白小燕，邱樹(shù)毅，雷安亮，陳美竹，黃魏，王曉丹*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州遵義563003；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

醬香白酒釀造過(guò)程中產(chǎn)多元醇功能酵母的篩選

白小燕1，4，邱樹(shù)毅1，3，雷安亮2，陳美竹1，3，黃魏1，3，王曉丹1，3*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州遵義563003；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

為了解醬香型白酒釀造過(guò)程中產(chǎn)多元醇酵母的種類和功能，以醬香型白酒大曲和酒醅中分離的酵母為研究對(duì)象，采用薄層層析法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法（HPLC-ELSD）對(duì)具有產(chǎn)多元醇功能的酵母進(jìn)行篩選和多元醇定性、定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從142株酵母菌中篩選出5株具有產(chǎn)多元醇功能的酵母菌婁德酵母（Lodderomyces elongisporus）FBKL2.0073、庫(kù)得畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）FBKL2.0008、Trichosporon coremiiformeFBKL2.0310、Trichosporon coremiiformeFBKL2.0307和Trichosporonoidessp.FBKL2.0315，其中前4株菌都能產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，L.elongisporusFBKL2.0073菌株產(chǎn)多元醇的總量最多，為（9.87±0.85）g/L。

酵母；薄層層析；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法；多元醇；D-阿拉伯糖醇

BAI Xiaoyan1,4,QIU Shuyi1,3,LEI Anliang2,CHEN Meizhu1,3,HUANG Wei1,3,WANG Xiaodan1,3*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Jane Wine Brewing Co.,Ltd.,Zunyi 563003,China;3.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;4.School of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

醬香型是中國(guó)白酒的四大基本香型之一，具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、飽滿味長(zhǎng)、空杯留香持久等特點(diǎn)。醬香型白酒的發(fā)酵窖池按出酒的風(fēng)格特征分上、中、下三層，窖池上層酒醅主要產(chǎn)醬香酒，中層酒醅主要產(chǎn)醇甜型酒，下層酒醅主要產(chǎn)窖底香型酒[1]。甜味是一種讓人感覺(jué)比較愉悅的口感，尤其在酒精度較高的白酒中，微甜味能使酒體顯得綿柔醇厚，而目前白酒缺少醇甜的風(fēng)格特征，一些生產(chǎn)企業(yè)為了改善白酒口感，降低成本獲取經(jīng)濟(jì)利益，向其中違規(guī)添加甜味劑（糖精鈉、甜蜜素、甜味素等）[2]，有研究發(fā)現(xiàn)，糖精鈉、甜蜜素等一些人工甜味劑具有潛在致癌、致畸、損害腎功能的副作用，這給消費(fèi)者帶來(lái)巨大的安全隱患[3]。同時(shí)，強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定白酒中不允許添加任何甜味劑[4]。為滿足市場(chǎng)的這一需求，有必要對(duì)醇甜型酒進(jìn)行研究。

酵母是釀酒微生物家族的重要成員之一，從功能上主要分為兩大類：一類是產(chǎn)酒酵母[5-6]；另一類是產(chǎn)香酵母[7]。但是從相關(guān)文獻(xiàn)可以看到[8-9]，酵母除了具有產(chǎn)酒和產(chǎn)香的作用外，還具有產(chǎn)多元醇類物質(zhì)的作用。SPENCER J F等[10]研究發(fā)現(xiàn)，耐高滲酵母在高滲條件下可產(chǎn)生多元醇，代謝葡萄糖產(chǎn)生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇、山梨醇、麥芽糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇為主[11-12]。范光先等[13]也發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境中，高滲酵母產(chǎn)生的多元醇主要為D-阿拉伯醇或赤蘚糖醇，而在高鹽條件下產(chǎn)生的甘油居多。

多元醇是酒醅內(nèi)的酵母菌在生成酒精的同時(shí)發(fā)酵糖所產(chǎn)生的，由于糖不能進(jìn)入白酒中，因此多元醇是形成白酒中甜味的主要來(lái)源，其在酒內(nèi)可起緩沖作用，使白酒更加豐滿醇厚，甜度隨羥基數(shù)增多而增強(qiáng)[14]。由于多元醇沸點(diǎn)高，屬于不揮發(fā)醇類，不易隨蒸餾進(jìn)入酒中，因而在白酒中含量極低，定量分析的難度較大[15]，目前，對(duì)白酒中多元醇的檢測(cè)方法主要有薄層層析法（thinlayerchromatography，TLC）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD）[16]、液質(zhì)聯(lián)用法[17]、毛細(xì)管氣相色譜法[18]、離子色譜積分脈沖安培法[19-20]等。本實(shí)驗(yàn)以課題組前期從醬香型白酒釀造過(guò)程大曲和酒醅中分離的所有酵母為研究對(duì)象，通過(guò)建立薄層層析法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對(duì)酵母菌株產(chǎn)多元醇種類及含量進(jìn)行初步分析，研究醬香型白酒釀造過(guò)程中酵母產(chǎn)多元醇類物質(zhì)的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：本實(shí)驗(yàn)室從醬香型白酒酒醅及大曲中篩選并保藏的142株酵母菌。

紙層析顯色劑[21]：飽和硝酸銀丙酮溶液-氫氧化鈉酒精溶液；紙層析展開(kāi)劑：正丁醇∶冰乙酸∶水=5∶1∶2；多元醇標(biāo)樣：取相同體積的質(zhì)量濃度為0.01mg/mL的赤鮮糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液混合。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖2g，瓊脂2g，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。

高糖培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。

實(shí)驗(yàn)所用試劑均來(lái)自上海博威生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F254層析微晶纖維素板：武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；404146手持式折光儀：成都泰華光學(xué)有限公司；Milli-Q Academic密理博超純水儀：密理博（上海）貿(mào)易有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、AgilentG4260B蒸發(fā)光檢測(cè)器、AgilentHi-plexCa柱（300 mm×7.7 mm）：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 耐高滲酵母的篩選

酵母活化：將本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的酵母在YEPD平板培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)，活化8 h。

高糖培養(yǎng)：將活化酵母接入高糖培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，篩選出能在高糖培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)的酵母菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 搖瓶初篩

挑選在的高糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的耐高糖酵母，將其分別接種于含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d。用薄層層析法分析產(chǎn)物組成，選取產(chǎn)多元醇的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

1.3.3 搖瓶復(fù)篩

將初篩所得菌株，進(jìn)行活化，然后接入到種子培養(yǎng)液中在30℃、160 r/min擴(kuò)培24 h，制得種子培養(yǎng)液，將各酵母種子液按5%的接種比例接種至含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d，每組做3個(gè)平行。分別測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)橇?、可溶性固形物含量，選取具有穩(wěn)定性狀、多元醇產(chǎn)量較高的菌株作為研究對(duì)象。

1.3.4 測(cè)定方法

可溶性固形物與殘?zhí)橇繙y(cè)定：酵母發(fā)酵液5000r/min離心后取上清，用阿貝折光儀測(cè)定其中的可溶性固形物含量。

殘?zhí)橇繙y(cè)定：參見(jiàn)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》中的直接滴定法測(cè)定[22]。

多元醇產(chǎn)物進(jìn)行初步定性和粗定量：根據(jù)測(cè)定單一標(biāo)樣和混合標(biāo)樣的展開(kāi)效果，來(lái)確定一種適用于分析酵母產(chǎn)多元醇的薄層層析法，優(yōu)化并確認(rèn)的層析條件。樣品處理方法如下：取不同菌株的發(fā)酵液各1 mL，10 000 r/min離心10 min，用毛細(xì)吸管將上清點(diǎn)樣于微晶纖維素板上，層析時(shí)間為4 h，層析結(jié)束后自然晾干，層析圖譜的顯色采用飽和硝酸銀丙酮溶液-氫氧化鈉酒精溶液[21]。

HPLC-ELSD法測(cè)量條件：AgilentHi-plexCa柱（300mm× 7.7 mm），柱溫為70℃，進(jìn)樣量為4 μL，以純水水為流動(dòng)相，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），霧化溫度為60℃，蒸發(fā)溫度為60℃，流速0.5 mL/min，載氣為氮?dú)狻?/p>

準(zhǔn)確配制葡萄糖、阿拉伯糖醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇及山梨醇質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。準(zhǔn)確配制5種糖醇混合儲(chǔ)備液，使用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度為0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

測(cè)定前，準(zhǔn)確吸取5mL發(fā)酵液于試管，65℃水浴10min，轉(zhuǎn)移到離心管中10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)C18固相萃取小柱凈化，收集濾液5 mL，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高滲酵母的篩選

通過(guò)在高糖培養(yǎng)基上酵母生長(zhǎng)的結(jié)果顯示，142株酵母有131株能生長(zhǎng)。這可能與醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程有關(guān)，因?yàn)檫@些酵母是從大曲和酒醅分離培養(yǎng)來(lái)的，而大曲和酒醅本身就是高溫、高糖、高滲的環(huán)境，所以在這種環(huán)境下篩選出來(lái)的酵母在高糖培養(yǎng)基中能夠存活[23]。

2.2 搖瓶發(fā)酵初篩

將在高糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)初篩，再借助薄層層析法對(duì)發(fā)酵液中的多元醇含量進(jìn)行初步分析。結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。

表1 產(chǎn)多元醇酵母的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of polyhydric alcohol-producing yeasts

圖1 發(fā)酵液中多元醇的薄層層析圖Fig.1 TLC of polyhydric alcohols in fermentation broth

最終，選出了產(chǎn)D-阿拉伯醇量最多的菌株FBKL2.0218、FBKL2.0073、FBKL2.0301、FBKL2.0111、FBKL2.0130以及產(chǎn)山梨醇較多的菌株FBKL2.0307、產(chǎn)山梨醇和木糖醇的菌株FBKL2.0310、產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株FBKL2.0315、產(chǎn)麥芽糖醇的菌株FBKL2.0008酵母菌株共9株菌。由表1可知，許多酵母具有產(chǎn)多元醇的能力，其中以D-阿拉伯糖醇較為常見(jiàn)，有的發(fā)酵液還伴隨少量的甘油生成[24]。從產(chǎn)多元醇酵母的來(lái)源上看，主要是來(lái)自于大曲，酒醅中較少，這可能與大曲和酒醅的環(huán)境差異有關(guān)，醬香型白酒是以小麥為原料的高溫大曲，是白酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑，含糖量高且溫度高，提供了高滲環(huán)境，在這種環(huán)境中篩選出來(lái)的酵母更能利用糖生成多元醇[25]。由圖1可以看出，該實(shí)驗(yàn)條件下，各種糖醇能很好分開(kāi)，分離效果及重現(xiàn)性良好，因而可以用于初步分析發(fā)酵液中的糖醇類物質(zhì)，其中葡萄糖顯色斑點(diǎn)，說(shuō)明菌株FBKL2.0301和FBKL2.0307發(fā)酵液中殘?zhí)呛扛撸粠追N多元醇斑點(diǎn)中，D-阿拉伯醇顯色斑點(diǎn)最大最黑，說(shuō)明D-阿拉伯醇含量高。

2.3 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

將初篩中產(chǎn)多元醇含量較高的9株菌株分別接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得復(fù)篩結(jié)果如表2。

表2 產(chǎn)多元醇酵母的復(fù)篩結(jié)果Table 2 Secondary screening results of polyhydric alcohol-producing yeasts

由表2可知，同其他酵母相比，相同條件下，菌株FBKL 2.0073、FBKL2.0008、FBKL2.0307、FBKL2.0310、FBKL2.0315的發(fā)酵液中殘?zhí)橇扛?，固形物含量與殘?zhí)橇坎钪蹈?，且結(jié)合表1和圖1可以看出，這些酵母發(fā)酵液對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物斑點(diǎn)更大，因而其多元醇產(chǎn)物的量可能更高。但還需要借助高效液相色譜方法來(lái)準(zhǔn)確對(duì)酵母產(chǎn)多元醇的種類和產(chǎn)量做進(jìn)一步分析。

2.4 高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵液中多元醇產(chǎn)量測(cè)定

根據(jù)初篩和復(fù)篩結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)篩選出5株葡萄糖殘量低且多元醇產(chǎn)率相對(duì)較高的菌株FBKL2.0073、FBKL2.0008、FBKL2.0307、FBKL2.0310、FBKL2.0315作為發(fā)酵出發(fā)菌株，利用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵液中多元醇種類、含量進(jìn)行分析。根據(jù)測(cè)得的峰面積與對(duì)應(yīng)的糖醇濃度進(jìn)行線性回歸，可得到5種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，5種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)R為0.996～0.999，在線性范圍內(nèi)各種糖醇的含量與峰面積有很好的線性關(guān)系，檢出限在0.045～0.058 mg/mL范圍內(nèi)，經(jīng)高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵液中多元醇產(chǎn)量測(cè)定，得到色譜圖（見(jiàn)圖2）。

表35 種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性范圍及檢出限Table 3 Regression equations,correlation coefficients and limit of detection of five standards

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和部分發(fā)酵液樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard substance and part fermention broth samples

由圖2可知，發(fā)酵液FBKL2.0008產(chǎn)麥芽糖醇和D-阿拉伯糖醇；發(fā)酵液FBKL2.0315產(chǎn)赤蘚糖醇；發(fā)酵液FBKL2.0310產(chǎn)甘油、D-阿拉伯糖醇、木糖醇和山梨醇，且由于殘?zhí)橇窟^(guò)高，葡萄糖已經(jīng)超出檢測(cè)線，出現(xiàn)平頭峰；發(fā)酵液FBKL2.0073產(chǎn)D-阿拉伯糖醇；發(fā)酵液FBKL2.0307產(chǎn)D-阿拉伯糖醇和山梨醇，總之，酵母所產(chǎn)多元醇主要為D-阿拉伯糖醇。

利用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵液中多元醇含量進(jìn)行測(cè)定，將峰面積帶入相應(yīng)回歸方程可得到各多元醇的產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，菌株FBKL2.0073產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的含量相對(duì)最高，為（9.870±0.85）g/L。且其產(chǎn)多元醇的種類及總量最多，同時(shí)產(chǎn)三種糖醇。但總的來(lái)說(shuō)，從醬香型白酒釀造過(guò)程中篩選出的酵母產(chǎn)多元醇的能力都是較低的[26-28]。這可能與菌株的來(lái)源有關(guān)，高產(chǎn)多元醇的酵母菌株多是從含糖量豐富的樣品（蜂蜜、花粉）中篩選[9]，本次實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源于大曲和酒醅，相比之下，可利用的糖類物質(zhì)較少。

表4 不同酵母發(fā)酵液中多元醇含量Table 4 Polyhydric alcohol contents in different yeast fermentation broth

3 結(jié)論

本研究篩選出5株產(chǎn)多元醇酵母菌株婁德酵母（Lodderomyceselongisporus）FBKL2.0073、庫(kù)得畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）FBKL2.0008、TrichosporoncoremiiformeFBKL 2.0310、Trichosporon coremiiformeFBKL2.0307和Trichosporonoidessp.FBKL2.0315，其中Lodderomyces elongisporus FBKL2.0073菌株產(chǎn)多元醇的總量最多，為（9.870±0.85）g/L。從醬香型白酒釀造過(guò)程中大曲和酒醅里分離的大部分酵母均有產(chǎn)生多元醇類物質(zhì)的能力，分別為D-阿拉伯糖醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇、甘油、木糖醇、山梨醇，其中以產(chǎn)D-阿拉伯糖醇較為常見(jiàn)且產(chǎn)量也最高。

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0254-5071（2017）05-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.012

2017-01-07

貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2017]2319）；貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6012）

白小燕（1990-），碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。

*通訊作者：王曉丹（1980-），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。