程奔，李嘯，*，許超群，黃聰，李建華，鄭念，李勇

（1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

金屬離子對(duì)低糖酵母發(fā)酵活性的影響

程奔1，李嘯1，2*，許超群1，黃聰1，李建華2，鄭念3，李勇3

（1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；3.安琪酵母伊利有限公司，新疆伊利835000）

該研究考察了3種金屬離子對(duì)低糖酵母發(fā)酵活力的影響。首先，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)酵母發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出3個(gè)主要因素：鎂離子（Mg2+）、鋅離子（Zn2+）、錳離子（Mn2+）。在這個(gè)基礎(chǔ)上應(yīng)用最陡爬坡路徑法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，然后利用響應(yīng)面分析法確定最佳培養(yǎng)基配方為酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化鎂6.95 g/L、氯化鋅1.78 mg/L、一水合硫酸錳0.069 mg/L。其次，將優(yōu)化培養(yǎng)基配方應(yīng)用于低糖酵母發(fā)酵，干酵母活力可達(dá)426.86 mL/g。經(jīng)過3次平行試驗(yàn)的驗(yàn)證，實(shí)際的平均發(fā)酵活力與預(yù)測的發(fā)酵活力值相近，比優(yōu)化前提高了24.8%。此研究對(duì)低糖酵母的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

低糖酵母；發(fā)酵活力；金屬離子；最陡爬坡試驗(yàn)；響應(yīng)面法

CHENG Ben1,LI Xiao1,2*,XU Chaoqun2,HUANG Cong1,LI Jianhua1,ZHENG Nian3,LI Yong3
(1.College of Biological and Pharmaceutical,China Three Gorges University,Yichang 443003,China; 2.Angel Yeast Co.,Ltd.,Yichang 443003,China;3.Angel Yeast Yili Co.,Ltd.,Yili 835000,China)

酵母菌通常為圓形、橢圓形或臘腸形，可以發(fā)酵多種碳水化合物，屬于兼性厭氧微生物，在有氧和無氧狀態(tài)下都能生存和繁衍。酵母菌細(xì)胞含有4.5%～8.5%的核糖核酸[1]、約2%的B族維生素以及多種礦物質(zhì)，此外，一些酵母菌還具有富集微量元素的作用[2]。酵母菌細(xì)胞壁含有多種可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力的活性物質(zhì)[3]。面包酵母是一種用來發(fā)面的具有發(fā)酵活性的酵母，根據(jù)用途的不同分為高糖酵母和低糖酵母。低糖酵母不能耐受高的滲透壓，在無糖條件下發(fā)酵力較高，因此適宜于含糖＜7%的面包發(fā)酵。一般用于生產(chǎn)咸面包、主食面包、無糖饅頭、咸糕點(diǎn)和蘇打餅干等。全球有很多國家以面包為日常主食，目前，全球消費(fèi)人口超過18億，在中國其消費(fèi)量也在逐年增加[4]。隨著人民生活水平的提升，低糖、低脂的烘焙食品的前景相當(dāng)廣闊。因此對(duì)于提高低糖酵母發(fā)酵活性的研究非常有必要。

酵母等微生物在生長過程中需要依靠無機(jī)鹽來維持細(xì)胞的滲透壓，同時(shí)各種礦物質(zhì)元素如鈣、鐵、鋅、錳等對(duì)酶及酶活等的作用有著重要影響[5-9]。華艷艷等[10]研究表明，在種子培養(yǎng)基中添加Mn2+能明顯提高紅發(fā)夫酵母的β-D-葡萄糖苷酶的活性并改變細(xì)胞的形態(tài)；在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 g/L Mn2+，能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長及蝦青素合成；吳澤柱等[11]研究表明，對(duì)培養(yǎng)基營養(yǎng)鹽進(jìn)行優(yōu)化可以有效地提升酵母發(fā)酵力；卞芙蓉等[12]研究表明，在培養(yǎng)基中加入一定量的金屬離子對(duì)于提高谷胱甘肽產(chǎn)量具有良好的效果。

培養(yǎng)基優(yōu)化方法眾多，其中以響應(yīng)面法的效果最好[13]。響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法（response surface methodology，RSM）是通過對(duì)回歸方程的分析從而尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，來解決多變量問題的一種方法，同時(shí)也是優(yōu)化條件、降低成本、提高效率、解決生產(chǎn)實(shí)際等問題的一種切實(shí)有效的統(tǒng)計(jì)方法[14-17]。本研究主要采用了Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡路徑法以及響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法探討了8種金屬離子對(duì)低糖酵母發(fā)酵活性的影響，并得到優(yōu)化的培養(yǎng)基配方。此研究對(duì)低糖酵母的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）FX-2、酵母抽提物（FM888）、蛋白胨（FM318）：安琪酵母股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母抽提物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20g/L。若配制YPD固體培養(yǎng)基，在YPD培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂粉。培養(yǎng)基在115℃條件下滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫?fù)u床：上海智城生物科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；SPX-150生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；雙向三速打面機(jī)：美國Hobart公司；SJA發(fā)酵力測定儀：瑞典SJA公司。

1.3 方法

1.3.1 甘油菌制備

從生產(chǎn)線上取低糖酵母種子，用一定量的蒸餾水稀釋成菌懸液，將菌懸液按照梯度進(jìn)行稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），用100 μL移液槍從不同梯度稀釋液中取0.1 mL液體注入平板培養(yǎng)基（YPD固體培養(yǎng)基）上，用涂布棒涂抹均勻后將平板蓋好，倒置放于28℃恒溫箱中培養(yǎng)72h，每個(gè)稀釋梯度3個(gè)重復(fù)。選出具有典型酵母菌菌落特征的單菌落，在分離培養(yǎng)基（YPD瓊脂培養(yǎng)基）上劃線2～3次，進(jìn)行純化。分離純化得到的單菌落接入裝有100mLYPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下培養(yǎng)20 h[18]。將培養(yǎng)好的菌液與滅菌后的甘油按照7∶3比例混合，搖勻后于-20℃條件下保藏。

1.3.2 發(fā)酵方法及培養(yǎng)條件[18]

將實(shí)驗(yàn)室保藏的低糖酵母菌種用YPD斜面活化，恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2～3 d。將活化好的斜面接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，在溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)30 h，獲得液體種子。試驗(yàn)培養(yǎng)基中接入5%的液體種子，在溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)20 h。

1.3.3 無糖酵母發(fā)酵活力測定[19]

利用布氏漏斗進(jìn)行發(fā)酵液抽濾，至無水為止，獲得鮮酵母；稱取4.0 g氯化鈉至250 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水溶解，制成濃度為2.7%的鹽水溶液。稱取280.0 g中筋小麥粉，倒入和面機(jī)內(nèi)，另稱取6.0 g鮮酵母于50 mL小燒杯中，加入少許上述鹽水溶解鮮酵母，將溶解后的鮮酵母倒入和面機(jī)面粉中，并用剩下的鹽水溶液將燒杯壁上殘余的鮮酵母洗滌干凈后全部倒入和面機(jī)中面粉上，計(jì)時(shí)，混合攪拌5 min，控制面團(tuán)溫度為（30±0.2）℃，將面團(tuán)放入SJA發(fā)酵儀的不銹鋼盒中，送入活力室內(nèi)。發(fā)酵溫度為（30±0.2）℃，調(diào)節(jié)記錄儀零點(diǎn)，關(guān)閉放氣小孔，從和面開始后第7分鐘后開始計(jì)時(shí)，記錄第1、第2、第3小時(shí)面團(tuán)產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w量，以第2、第3小時(shí)面團(tuán)產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w量之和為該酵母的發(fā)酵力，結(jié)果用毫升數(shù)表示。在本研究中采用的是每克干酵母的活力值作為響應(yīng)值，因此將實(shí)際檢測活力進(jìn)行折算。折算方法為每克干物質(zhì)含量對(duì)應(yīng)活力值=實(shí)際檢測活力值/樣品干物質(zhì)含量

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)找出的顯著因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，需要先逼近最佳區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面方程。最陡爬坡法實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用N=12和因子數(shù)（N-1）為11的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高（+1）和低（-1）2個(gè)水平，根據(jù)文獻(xiàn)查閱，確定了銅離子（A）、鈉離子（B）、鎂離子（D）、鉀離子（E）、亞鐵離子（G）、鈣離子（H）、鋅離子（J）、錳離子（K）這8個(gè)因素作為PB試驗(yàn)的考察對(duì)象。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，以快速逼近最佳區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。找到低糖酵母活力最高的處理，即為下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

1.3.7 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，顯著因素以中心點(diǎn)為零水平，高水平和低水平分別比零水平高于或低于一個(gè)實(shí)際步長，用DesignExpert軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

使用Minitab16軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，選擇了試驗(yàn)次數(shù)N=12和因子數(shù)（N-1）為11的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以C、F、I作為空項(xiàng)來估計(jì)試驗(yàn)誤差，其中A、B、D、E、G、H、J、K則分別代表銅離子、鈉離子、鎂離子、鉀離子、亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、錳離子，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，以每克干物質(zhì)含量對(duì)應(yīng)的活力值作為響應(yīng)值，Plackett-Burman試驗(yàn)的因素與水平見表1。這些離子是分別以CuSO4·5H2O、NaCl、MgCl2·6H2O、KCl、FeCl2、CaCl2、ZnCl2、MnSO4·H2O的形式加入到培養(yǎng)基中。

表1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2為Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對(duì)結(jié)果的影響（En）就是該因素高（Rh）和低（Rl）結(jié)果之差的平均值，即En=（Rh-Rl）/6。t檢驗(yàn)是用來比較真實(shí)變量和名義變量效應(yīng)之間的顯著性，從而判斷該因素的相對(duì)重要性。由表3可以看到，各因素所代表的參數(shù)、水平及T值和P值。P值越小，則說明結(jié)果與對(duì)照的差異越顯著，對(duì)低糖酵母發(fā)酵活力具有顯著影響的因子依次是K＞J＞D，即錳離子＞鋅離子＞鎂離子，確定這三個(gè)因素作為下一步試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

表2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)表3中各因素的P值進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，D、J、K3個(gè)因素P值最小，因此相對(duì)差異性最顯著。再根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果可以估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng)，結(jié)果見表4。由表4可知，隨著鋅離子濃度逐漸減小，錳離子、鎂離子濃度逐漸增大，低糖酵母發(fā)酵活力呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當(dāng)鎂離子質(zhì)量濃度在900 mg/L，鋅離子質(zhì)量濃度在0.8 mg/L，錳離子質(zhì)量濃度在0.024 mg/L時(shí)，低糖酵母發(fā)酵活力達(dá)到最大，因此將第3組試驗(yàn)的條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the steepest ascent experiments

2.3 響應(yīng)面分析法

以鎂離子900mg/L，鋅離子0.8mg/L，錳離子0.024mg/L為中心點(diǎn)，以每克酵母干物質(zhì)對(duì)應(yīng)的活力值作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，各自變量水平見表5，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。由表7可知，回歸模型的P值（Prob＞F）=0.005，這表明該模型是顯著的；而失擬值3.05＜4，則表明該模型失擬現(xiàn)象不顯著；根據(jù)表中的P值還可以看到，該模型的線性、平方的影響是顯著的，但交互作用影響不顯著?？芍撃Ｐ偷幕貧w系數(shù)R2=0.961 4，R2adj=0.891 8，表明模型擬合度很好。經(jīng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)式方程：

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments design

表6Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 6 Results of Box-Behnken experiments design

表7Box-Behnken設(shè)計(jì)方差分析Table 7 Variance analysis of Box-Behnken design

根據(jù)上述擬合回歸方程作出響應(yīng)分析圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，響應(yīng)面最高點(diǎn)表示活力的最大預(yù)測值，由鋅離子與鎂離子及錳離子的交互作用可以看出，鋅離子、鎂離子、錳離子趨近于某一濃度時(shí)，酵母發(fā)酵活力有最大預(yù)測值，即發(fā)酵活力的模型方程有最優(yōu)解。說明該模型設(shè)計(jì)合理。

圖1 不同含量鋅離子、鎂離子、錳離子交互作用對(duì)酵母活力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between different concentrations of Mg2+, Zn2+and Mn2+on yeast activity

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)求得的最優(yōu)回歸方程和試驗(yàn)結(jié)果，得到最優(yōu)的金屬離子組合：六水合氯化鎂質(zhì)量濃度為6.949 g/L、氯化鋅質(zhì)量濃度為1.780mg/L、一水合硫酸錳質(zhì)量濃度為0.0687mg/L，酵母活力可達(dá)426.859 mL/g。為了驗(yàn)證優(yōu)化的可靠性，在該濃度下進(jìn)行了重復(fù)搖瓶試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果分別為424.5mL/g、420.66mL/g、428.3mL/g，平均值為424.487mL/g，與預(yù)測值426.859 mL/g接近，二者的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。優(yōu)化后得到的低糖酵母發(fā)酵確定最佳培養(yǎng)基配方為酵母抽提物（FM888）10g/L，蛋白胨（FM318）20g/L，葡萄糖20 g/L，六水合氯化鎂6.949 g/L、氯化鋅1.78 mg/L、一水合硫酸錳0.068 7 mg/L。

3 結(jié)論

本研究通過Plackett-Burman試驗(yàn)從眾多金屬離子中篩選出了3種對(duì)低糖酵母發(fā)酵活力有顯著影響的因子及濃度范圍，進(jìn)一步通過最陡爬坡路徑試驗(yàn)確定響應(yīng)值區(qū)域，最后通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)、Design-Expert軟件分析，得到優(yōu)化確定最佳培養(yǎng)基配方為酵母抽提物（FM888）10 g/L、蛋白胨（FM318）20 g/L、葡萄糖20 g/L、六水合氯化鎂6.949 g/L、氯化鋅1.780 mg/L、一水合硫酸錳0.068 7 mg/L。在搖瓶中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到優(yōu)化條件下酵母干物質(zhì)活力平均值為424.487 mL/g，優(yōu)化后每克干物質(zhì)發(fā)酵活力提高了24.8%，對(duì)低糖酵母活力的提升具有明顯效果，對(duì)于低糖酵母的生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)作用。

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Q93-335

0254-5071（2017）05-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.011

2017-03-12

湖北省自然科學(xué)基金（ZRS2015000013）

程奔（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵過程控制。

*通訊作者：李嘯（1969-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锓磻?yīng)過程優(yōu)化與控制。