趙海洲，陳永星，李楠，楊旭，李賽男，劉文華

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061）

丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制

趙海洲，陳永星，李楠，楊旭，李賽男，劉文華

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061）

目的研究丁氟螨酯對(duì)人經(jīng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制。方法加入丁氟螨酯0.03，0.06，0.125，0.25，0.5，1，2，2.6，4，6，8和16 mmol·L-1處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活；DCFH-DA熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；JC-1標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位；Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)；碘化丙啶（PI）染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡；Western蛋白印跡法檢測(cè)磷酸化P38蛋白（p-P38）和磷酸化Jun激酶（p-JNK）表達(dá)水平。結(jié)果與溶劑（DMSO）對(duì)照組相比，共孵育48 h后，丁氟螨酯≥0.06 mmol·L-1時(shí)可降低細(xì)胞存活率（P＜0.05），且隨濃度增高細(xì)胞存活率有降低趨勢(shì)，IC50為2.6 mmol·L-1；丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1組細(xì)胞ROS水平升高（P＜0.01），線粒體膜電位下降（P＜0.01）。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1組SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)顆粒狀熒光，細(xì)胞核固縮和崩解；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1組細(xì)胞凋亡率由DMSO對(duì)照組的（0.7±0.1）%分別上升至（6.7±0.1）%，（72.4±8.6）%和（90.7±3.2）%（P＜0.01）；丁氟螨酯4和6 mmol·L-1組G1期細(xì)胞較DMSO對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；Western蛋白印跡結(jié)果表明，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1組p-JNK表達(dá)均升高（P＜0.01），丁氟螨酯6 mmol·L-1組p-P38表達(dá)水平增加（P＜0.01）。結(jié)論丁氟螨酯可能通過(guò)氧化損傷、激活P38蛋白和JNK蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞G1期阻滯和凋亡。

丁氟螨酯；SH-SY5Y細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；活性氧；應(yīng)激反應(yīng)

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡，其致病原因主要有年齡老化、遺傳因素和環(huán)境毒素等［1-2］。含氟農(nóng)藥主要用作殺蟲劑、除草劑和殺螨劑等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及日常生活中使用較為普遍，一般認(rèn)為這類農(nóng)藥對(duì)人的毒性相對(duì)較?。?］。但近期研究表明，含氟農(nóng)藥可能具有潛在的神經(jīng)毒性，如氟蟲腈引起人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞凋亡［4］；大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元減少［5］；高效三氟氯氰菊酯降低發(fā)育期大鼠紋狀體酪氨酸羥化酶蛋白表達(dá)［6］；氟啶胺引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡［7］。

丁氟螨酯（cyflumetofen）是由日本大冢公司開發(fā)的新型含氟農(nóng)藥，于2007年獲準(zhǔn)公開銷售，主要用于果樹、蔬菜和茶樹等農(nóng)作物和花卉上螨蟲、紅蜘蛛的防治，尤其對(duì)幼螨的殺毒作用更強(qiáng)。丁氟螨酯對(duì)螨蟲和紅蜘蛛具有特異性毒殺效果，對(duì)昆蟲類和魚類等其他生物的毒性較低，其防治效果較以往的殺螨劑具有較大優(yōu)勢(shì)，一般認(rèn)為丁氟螨酯殺螨毒性專一，對(duì)其他物種毒性較小。目前研究主要集中在合成、活性研究及環(huán)境殘留測(cè)定上［8-10］。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織會(huì)議證實(shí)，丁氟螨酯對(duì)于雄性大鼠具有潛在的致癌作用［11］。Yoshida等［12］發(fā)現(xiàn)，丁氟螨酯長(zhǎng)期經(jīng)胃給藥引起大鼠肝、腎腫大，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞空泡化。Li等［13］認(rèn)為，丁氟螨酯在水中的主要降解產(chǎn)物B-3具有較強(qiáng)的致突變作用。丁氟螨酯已在15個(gè)國(guó)家廣泛注冊(cè)和應(yīng)用［14］，但關(guān)于其神經(jīng)毒性方面的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，開展其神經(jīng)毒性的研究具有重要意義。

SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)和生理生化功能類似于神經(jīng)細(xì)胞，常作為細(xì)胞模型用于神經(jīng)毒理藥理研究［15］。本研究使用SH-SY5Y細(xì)胞研究丁氟螨酯的毒性作用，并進(jìn)一步探討其毒性機(jī)制，為該農(nóng)藥的合理使用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；丁氟螨酯（純度95%，美國(guó)Alfa Chemistry公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶和PBS（美國(guó)Gibco公司）；MTT、DMSO、Hoechst 33258和碘化丙錠（美國(guó)Sigma公司）；活性氧（reactive oxy?gen species，ROS）、線粒體膜電位（△Ψm）、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及細(xì)胞裂解液（江蘇碧云天公司）；ECL發(fā)光液（上海天能科技有限公司）；兔抗人Jun激酶（Jun kinase，JNK）2/MBP多克隆抗體、兔抗人磷酸化SAPK/JNK（p-JNK）（Thr183/Tyr185）（81E11）單克隆抗體、兔抗人P38蛋白（D13E1）XP單克隆抗體和兔抗人磷酸化P38蛋白（p-P38）（Thr180/Tyr182）（12F8）單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；兔抗人β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Merck Millipore公司）；其余試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

HEARACELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱和離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ELx800型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；ECLIPSE TS100倒置和ECLIPSE Ci正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Tanon 4200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1及鏈霉素100 mg·L-1的高糖DMEM培養(yǎng)基在恒溫37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，用對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

每孔1×104個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。丁氟螨酯用DMSO溶解，初濃度為1 mol·L-1，使用時(shí)用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋后加入96孔板中，藥物終濃度范圍0.03～16 mmol·L-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白組（只有培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞）、溶劑（0.09%DMSO）對(duì)照組和丁氟螨酯（0.03～16 mmol·L-110個(gè)濃度梯度）組，每組設(shè)3復(fù)孔，作用48 h后每孔加入200μL MTT（0.5 g·L-1），孵育4 h，棄上清，加入200μL DMSO溶解甲瓚，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值（A490nm）。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A490nm－空白組A490nm）/（對(duì)照組A490nm－空白組A490nm）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Excel自帶函數(shù)擬合曲線，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖得出IC50［16］。

1.4 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中ROS水平

每孔6×104個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，設(shè)丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1組，同時(shí)設(shè)溶劑（DMSO）對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞染色。參照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測(cè)。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照，用熒光強(qiáng)度對(duì)ROS進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位

按1.4分組處理細(xì)胞，參考線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書用JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的比值表示線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核

24孔板中加入無(wú)菌玻片，使用100 mg·L-1多聚賴氨酸浸泡30 min，PBS洗3次，每孔接種6×104細(xì)胞。設(shè)丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1處理組，同時(shí)設(shè)溶劑（DMSO）對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入4%多聚甲醛固定液于4℃作用15 min，PBS洗2次，然后加入Hoechst 33258 10 mg·L-1室溫避光染色10 min，PBS洗2次。將玻片取出，倒扣于載玻片上，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞核形態(tài)改變。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

按1.6分組處理細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化，取細(xì)胞1×106～2×106，3 mL PBS洗1次，3 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1000×g離心5 min，棄上清。加入500μL PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個(gè)細(xì)胞，用終濃度75%乙醇-20℃過(guò)夜固定。上機(jī)前，取固定好的細(xì)胞，4℃，1000×g離心5 min，棄固定液，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次以去除乙醇，4℃，1000×g離心5 min，棄上清。加500μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，加50μL RNA酶（1 g·L-1），37℃水浴30 min。之后加碘化丙錠（終濃度為50 mg·L-1，含0.1%Triton X-100），4℃避光染色30 min。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管，使用流式細(xì)胞儀收集3×104細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡率（%）=亞二倍體峰細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm。

1.8 Western蛋白印跡法檢測(cè)P38和JNK蛋白表達(dá)

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，待第2天細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度，按1.6分組處理細(xì)胞，用PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，4℃搖床輕輕振蕩裂解細(xì)胞，15 000×g離心15 min后吸取上清，BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。Western蛋白印跡檢測(cè)應(yīng)激蛋白P38，p-P38，JNK和p-JNK的表達(dá)。以Image J軟件分析各條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白/IAβ肌動(dòng)蛋白的比值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁氟螨酯對(duì)細(xì)胞存活率的影響

不同濃度丁氟螨酯處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1。與DMSO對(duì)照組相比，丁氟螨酯0.06 mmol·L-1時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞存活率開始下降（P＜0.05）；＜2 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率降低較緩慢（P＜0.01）；＞2 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率迅速降低（P＜0.01）。隨著丁氟螨酯濃度增加，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用有增強(qiáng)趨勢(shì)，48 h半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.6 mmol·L-1。

Fig.1 Effect of cyflumetofen on cell viability by MTT assay.SH-SY5Y cells were exposed to different concentra?tions of cyflumetofen for 48 h at 37°C.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

2.2 丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

相差顯微鏡明場(chǎng)照片表明（圖2A），DMSO對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形；丁氟螨酯1 mmol·L-1尚未改變細(xì)胞形態(tài)；2 mmol·L-1組部分細(xì)胞異常變圓；4和6 mmol·L-1組細(xì)胞形態(tài)變化較大，全部皺縮變圓。

DCFH-DA探針結(jié)果（圖2A和B）表明，與DMSO對(duì)照組相比，丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1組SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平顯著增加（P＜0.01），丁氟螨酯1和2 mmol·L-1組細(xì)胞ROS分別是DMSO對(duì)照組的25和31倍，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1組均是DMSO對(duì)照組的6倍。

Fig.2 Effect of cyflumetofen on reactive oxygen species（ROS）levels in SH-SY5Y cells detected by DCFH-DA staining.SH-SY5Y cells were treated with cyflumetofen for 48 h. A：the morphology in light field and ROS fluorography，respec?tively；B：semi-quantitative resultof ROS.FI：fluorescence intensity. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

2.3 丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1探針結(jié)果（圖3）表明，DMSO對(duì)照組顯示明顯紅色熒光，紅綠熒光比為7.3；丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1組綠熒光逐漸增強(qiáng)，紅綠熒光比分別下降至3.0，1.8，0.7和0.3（P＜0.01）。提示丁氟螨酯1，2，4和6 mmol·L-1組線粒體膜電位較DMSO對(duì)照組下降。

Fig.3 Effect of cyflumetofen on mitochondrial membrane potential（MMP）in SH-SY5Y cells detected by JC-1 staining.See Fig.2 for the cell treatment.B：the semi-quantita?tive result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO con?trol（0）group.

2.4 丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33258細(xì)胞核染色結(jié)果顯示（圖4），DMSO對(duì)照組細(xì)胞表現(xiàn)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，丁氟螨酯2 mmol·L-1組部分細(xì)胞有顆粒狀亮藍(lán)色點(diǎn)狀熒光。與DMSO對(duì)照組相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1組細(xì)胞主要表現(xiàn)為核固縮變小，亮藍(lán)色點(diǎn)狀聚集顆粒狀熒光；有部分細(xì)胞的細(xì)胞核已發(fā)生崩解。上述結(jié)果從細(xì)胞核形態(tài)上驗(yàn)證了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Fig.4 Effect of cyflumetofen on SH-SY5Y cell nuclei by Hoechst33258 staining.See Fig.2 for the celltreatment.↑：nucleic accumulation and nuclear shrinkage；△：nuclear dis?integration.

2.5 丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞周期分析（表1）發(fā)現(xiàn)，與DMSO對(duì)照組相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1組G1期細(xì)胞比例由48.0%分別上升至61.1%和89.8%（P＜0.01）。流式結(jié)果（圖5）顯示，與DMSO對(duì)照組相比，經(jīng)丁氟螨酯2，4和6 mmol·L-1處理的SH-SY5Y細(xì)胞在48 h均檢測(cè)到明顯的亞二倍體峰，細(xì)胞凋亡率由（0.7± 0.1）%分別上升至（6.7±0.1）%，（72.4±8.6）%和（90.7±3.2）%（n=3，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of cyflumetofen on cell cycle of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry

2.6 丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞p-JNK和p-P38表達(dá)的影響

Western蛋白印跡結(jié)果（圖6）顯示，與DMSO對(duì)照組相比，丁氟螨酯4和6 mmol·L-1作用48 h后，細(xì)胞p-JNK表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；丁氟螨酯6 mmol·L-1使p-P38表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。丁氟螨酯對(duì)細(xì)胞JNK和P38的表達(dá)水平?jīng)]有影響（數(shù)據(jù)略）。

Fig.5 Effect of cyflumetofen on apoptosis of SH-SY5Y cells detected by flow cytometry.A，B，C and D：cyflumetofen 0，2，4 and 6 mmol·L-1group，respectively.

Fig.6 Effect of cyflumetofen on expression of phos?phorylated Jun kinase（p-JNK）and p-P38 in SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B is the semi-quantitative re?sult of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control（0）group.

3 討論

丁氟螨酯于2007年批準(zhǔn)上市，目前關(guān)于其神經(jīng)毒理作用暫未見(jiàn)報(bào)道。本研究使用SH-SY5Y細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)丁氟螨酯的神經(jīng)毒性和作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，丁氟螨酯0.06 mmol·L-1即能顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，隨濃度的增加，抑制效果有增強(qiáng)趨勢(shì)，IC50為2.6 mmol·L-1。丁氟螨酯4和6 mmol·L-1作用48 h后，Hoechst33258染色顯示細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮和大量的凋亡小體。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明，在G1峰的左側(cè)檢測(cè)到亞二倍體峰，提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞G1期阻滯。

環(huán)境毒素是散發(fā)性PD的主要致病原因，而農(nóng)藥及其殘留物是環(huán)境毒素的重要來(lái)源之一。目前，殺蟲劑和除草劑等農(nóng)藥在糧食生產(chǎn)、蔬菜水果和園林綠化等領(lǐng)域普遍使用，給人們帶來(lái)了重大的安全隱患。一些以前認(rèn)為是“安全”的農(nóng)藥，采用新檢測(cè)方法和新毒理模型后，其毒性作用被逐步發(fā)現(xiàn)。

PD的病理原因是由于中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性死亡，并導(dǎo)致紋狀體中多巴胺遞質(zhì)含量減少而發(fā)生的。氧化損傷被認(rèn)為是引起細(xì)胞損傷、衰老、凋亡及死亡的重要原因。在過(guò)度氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS急劇增加，導(dǎo)致線粒體膜電位改變、線粒體DNA及電子傳遞鏈損傷，線粒體功能失調(diào)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡［17-18］。線粒體膜通透性增加，膜電位降低是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志。本研究結(jié)果表明，丁氟螨酯1和2 mmol·L-1對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用還相對(duì)較小，細(xì)胞形態(tài)基本正常，但細(xì)胞內(nèi)ROS水平已急劇升高；4和6 mmol·L-1組ROS水平比1和2 mmol·L-1組相對(duì)較低，其原因可能是4和6 mmol·L-1組細(xì)胞已大量死亡并裂解。線粒體膜電位結(jié)果顯示，丁氟螨酯1 mmol·L-1即引起線粒體膜電位顯著降低。上述結(jié)果表明，丁氟螨酯可以引起SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷，在高濃度的丁氟螨酯作用下，這種損傷又導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡和壞死。

細(xì)胞凋亡的過(guò)程十分復(fù)雜多樣。多個(gè)研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成員JNK和P38參與了凋亡過(guò)程調(diào)節(jié)。百草枯和魚藤酮通過(guò)激活JNK誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡［19-20］；P38的激活參與多巴胺能神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)PD進(jìn)程［21-22］。但也有研究報(bào)道JNK和P38的激活能夠抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞存活率［23］。本研究結(jié)果顯示，丁氟螨酯2 mmol·L-1作用48 h對(duì)p-JNK和p-P38的表達(dá)都沒(méi)有影響；4 mmol·L-1作用后引起p-JNK顯著升高；6 mmol·L-1作用后p-JNK進(jìn)一步升高，p-P38也明顯增加。這些結(jié)果與上述丁氟螨酯4和6 mmol·L-1顯著抑制SH-SY5Y存活、誘導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡具相關(guān)性，提示JNK和P38參與了丁氟螨酯誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞毒性過(guò)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，丁氟螨酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有毒性損傷作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G1期阻滯，其信號(hào)通路可能與氧化應(yīng)激引起的線粒體功能失調(diào)、以及應(yīng)激蛋白JNK和P38的激活有關(guān)。丁氟螨酯屬新型農(nóng)藥，在國(guó)內(nèi)的需求將可能穩(wěn)定增長(zhǎng)。因此，對(duì)其進(jìn)行全面系統(tǒng)的毒理作用研究十分緊迫和必要。

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Cytotoxicity of cyflumetofen on SH-SY5Y cells and possible mechanism

ZHAO Hai-zhou,CHEN Yong-xing,LI Nan,YANG Xu,LISai-nan,LIU Wen-hua
(Schoolof Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqin g 526061,China)

OBJECTIVETo investigate the cytotoxicity of cyflumetofen for SH-SY5Y cells and the mechanism.METHODSSH-SY5Y cells treated with cyflumetofen 0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,2.6, 4,6,8 and 16 mmol·L-1for 48 h.Cellsurvivalwas measured with MTT assay.The reactive oxygen species (ROS)was determined with the DCFH-DA probe,and mitochondrialmembrane potential(MMP)was detected by JC-1 staining.The morphologicalchanges in cellnucleiwere observed with Hoechst33258 staining.Cellcycle and apoptosis were determined by flow cytometry.The protein levels ofphosphorylated Jun Kinase(p-JNK)and p-P38 were measured by Western blotting.RESULTSCompared with solvent (DMSO)control group,cyflumetofen(≥0.06 mmol·L-1)inhibited the proliferation of SH-SY5Y cells obviously(P＜0.05),and the IC50was 2.6 mmol·L-1.MMP declined and ROS levels increased significantly in cyflumetofen 1,2,4 and 6 mmol·L-1groups(P＜0.01).Cyflumetofen 2,4 and 6 mmol·L-1induced nucleic accumulation,nuclear shrinkage and disintegration in SH-SY5Y cells.Apoptosis rates of cyflu?metofen 2,4 and 6 mmol·L-1groups increased from(0.7±0.1)%in DMSO controlgroup to(6.7±0.1)%, (72.4±8.6)%and(90.7±3.2)%(P＜0.01).Cyflumetofen 4 and 6 mmol·L-1induced G1phase cellcycle arrest(P＜0.01).In addition,Western blotting showed thatcyflumetofen 4 and 6 mmol·L-1up-regulated the expression ofp-JNK(P＜0.01),while the levelofp-P38 in SH-SY5Y cells was increased in cyflumetofen 6 mmol·L-1group(P＜0.01).CONCLUSIONCyflumetofen induces cell damage,apoptosis and G1phase cellcycle arrest in SH-SY5Y cells.The mechanism may be associated with oxidative damage, and activation of P38 and JNK stress-response pathways.

cyflumetofen;SH-SY5Y cells;apoptosis;reactive oxygen species;stress reaction

LIU Wen-hua,E-mail:wenhualiu@hotmail.com

R994.6，R996

：A

：1000-3002-（2017）04-0318-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.004

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31271124);Major Project of Bureau of Education of Guangdong Province(2014KZDXM075);and Innovation Team Project of Bureau of Education of Guangdong Province(2015KCXTD032)

2016-08-24接受日期：2017-03-16）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271124）；廣東省教育廳重大項(xiàng)目（2014KZDXM075）；廣東省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2015KCXTD032）

趙海洲，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事神經(jīng)藥理毒理學(xué)研究。

劉文華，E-mail：wenhualiu@hotmail.com