車海彥 曹學仁 劉勇 羅大全

摘 要 2016年在海南樂東、昌江、澄邁、?？?、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜葉片樣品6個，將樣品合并，采用小RNA深度測序技術對上述混合樣本的病毒種類進行鑒定，發(fā)現(xiàn)樣本中含有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papara ringspot virus，PRSV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和中國南瓜曲葉病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV），通過PCR方法進一步驗證了深度測序結果的準確性。SLCCNV在4個樣品中存在，P-CJ分離物的DNA-A和DNA-B組分全長分別為2 735 bp（登錄號為MF062251）和2 722 bp（登錄號為MF062252）。DNA-A和DNA-B組分均與SLCCNV分離物的同源性最高，同源性分別為89.2%～99.3%和79.1%～98.8%；P-CJ分離物與從中國植物樣品中分離到的SLCCNV聚在同一進化分支上。上述研究結果表明，P-CJ是SLCCNV的一個分離物。

關鍵詞 小RNA深度測序；海南；南瓜病毒病

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Abstract In 2016， 6 suspected virus-infected pumpkin leaf samples were collected from Ledong county， Changjiang county， Chengmai county， Haikou city， Wenchang county and Danzhou city， Hainan province. The above samples were pooled and analyze by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus（CMV）， Papaya ringspot virus（PRSV）， Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）and Squash leaf curl China virus（SLCCNV）were detected from the pooled sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus-specific PCR from above 6 samples. SLCCNV was detected from 4 samples， the virus isolate P-CJ was selected for further sequence analysis. The complete sequence of the DNA-A and DNA-B was determined to be 2 735 bp（MF062251）and 2 722 bp（MF062252）respectively. The DNA-A was most closely related to isolates of SLCCNV with 89.2%-99.3% nucleotide sequence identities. The DNA-B was most closely related to isolates of SLCCNV with 79.1%-98.8% nucleotide sequence identities. Phylogenetic analysis revealed that P-CJ isolate clustered with isolates of SLCCNV from China. These results confirmed this virus was an isolate of SLCCNV.

Key words Small RNA deep sequencing； Hainan； Pumpkin virus disease

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.018

中國南瓜（Cucurbita moschata）又名倭瓜，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita Linn.），在中國南北方廣泛種植，是海南冬季重要的北運蔬菜之一。病毒病在南瓜種植區(qū)幾乎都有發(fā)生，目前中國從南瓜上鑒定出的病毒主要有：黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、中國南瓜曲葉病毒（Squash leaf curl China virus，SLCCNV）等[1-8]。海南地處熱帶，獨特的氣候條件及南瓜種植面積的增加，導致病毒病發(fā)生日益嚴重。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒病在海南南瓜種植區(qū)發(fā)生普遍，部分田塊在生長中后期尤為嚴重。近年來小RNA深度測序技術已被應用于病毒和類病毒的鑒定和檢測中，該技術是一種廣譜的檢測病毒的手段，與傳統(tǒng)的ELISA和 PCR方法不同，不需要事先估計病毒的類型，無論是DNA病毒、RNA病毒還是類病毒，都能在一個測序反應中被檢測到，科研人員利用該技術在植物和昆蟲上鑒定了多種新的病毒[9-11]。目前還未見應用該技術對海南南瓜病毒種類進行鑒定的報道。本研究結合小RNA深度測序技術和PCR方法研究海南南瓜主要病毒種類，為南瓜病毒病的綜合防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年1月在海南樂東、昌江、澄邁、?？?、文昌和儋州采集疑似感染病毒病的南瓜葉片樣本共6份，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 南瓜葉片小RNA深度測序 文庫構建與測序：將表1中6個不同癥狀類型的樣品合并，建成1個cDNA文庫池（表1）。葉片總RNA提取采用TRIzolR Reagent（Invitrogen），文庫構建采用TruseqTM Small RNA sample prep Kit（Illumina），文庫回收采用6% Novex TBE PAGE gel，1.0 mm，10 well（Invitrogen），用TBS380 Picogreen微型熒光計進行定量，在TruSeq SR Cluster Kit v3-cbot-HS上進行PCR擴增，然后在Hiseq4000測序平臺進行深度測序，小RNA深度測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

生物信息學分析：利用Fastx-Toolkit軟件對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析，獲得clean small RNA序列，從上述序列中挑選高質(zhì)量序列進行長度分布統(tǒng)計，將質(zhì)控后的序列進行拼接，得到contigs，將上述contigs在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx比對，得到可能存在的病毒序列，對其進行統(tǒng)計并注釋。

1.2.2 田間樣品的PCR檢測驗證 葉片總DNA和總RNA提?。悍謩e采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒和植物總RNA提取試劑盒，提取方法詳見試劑盒說明。

cDNA合成：以提取的葉片總RNA為模板，使用TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

檢測引物：PRSV、CMV、CGMMV和粉虱傳雙生病毒（whitefly transmitted geminiviruses，WTGs）的檢測引物序列和反應條件見表2。

PCR產(chǎn)物克隆和測序：將PCR擴增的特異性片段產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T Simple 載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli Competent Cell DH5α中，利用PCR篩選陽性克隆。序列測定委托上海立菲生物技術有限公司。

1.2.3 中國南瓜曲葉病毒海南分離物的全基因組測序分析 根據(jù)小RNA深度測序結果，設計2對背向引物SLCCNV-A1/SLCCNV-A2和SLCCNV-B1/ SLCCNV-B2（表2），分別用于擴增昌江十月田鎮(zhèn)P-CJ樣品中SLCCNV的DNA-A和DNA-B組分，PCR產(chǎn)物克隆和測序參照1.2.2。

采用NCBI中的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行相似性查找。采用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進行序列比較。通過MEGA6.06軟件的Maximum likelihood法構建親緣關系樹，bootstrap replications值為1 000。

2 結果與分析

2.1 南瓜病毒病田間主要癥狀表現(xiàn)

海南南瓜病毒病田間主要表現(xiàn)為斑駁、曲葉、褪綠、皺縮、葉肉組織退化、節(jié)間縮短等癥狀，感病植株經(jīng)常同時表現(xiàn)幾種癥狀。6份樣品的田間癥狀見圖1。

2.2 感病南瓜葉片小RNA深度測序發(fā)現(xiàn)的病毒

南瓜葉片樣本小RNA深度測序共產(chǎn)生24 450 144條reads，經(jīng)質(zhì)量控制之后得到21 442 277 clean reads。提取長度為18～32 nt的序列進行拼接組裝，得到7 036個contigs，268個contigs可以比對到4種病毒序列，其中135個contigs可以比對到PRSV序列，同源性在83.12%～100.00%；61個contigs可以比對到SLCCNV序列，同源性在90.77%～100.00%；42個contigs可以比對到CMV序列，同源性在80.00%～100.00%；30個contigs可以比對到CGMMV序列，同源性在79.00%～100.00%。

2.3 田間樣品的PCR驗證

為了驗證小RNA深度測序結果的可靠性，利用PRSV、CGMMV、CMV和WTGs的特異性引物（表2）對采集的6個樣本進行了PCR檢測，擴增到與預期大小一致的特異性條帶（圖2），對上述特異性擴增產(chǎn)物進行測序及進一步分析。結果表明，PRSV在P-CM和P-HK 2個樣品中存在，GenBank登錄號分別為MF772332，MF772333；CGMMV在P-CM，P-HK，P-WC和P-DZ 4個樣品中存在，GenBank登錄號分別為MF772328，MF772329，MF772330，MF772331；CMV在所有檢測的6個樣品P-LD，P-CJ，P-CM，P-HK，P-WC，P-DZ中均存在，GenBank登錄號分別為MF772322，MF772323，MF772324，MF772325，MF772326，MF772327；WTGs在P-CJ，P-CM，P-HK和P-WC 4個樣品中存在，GenBank登錄號分別為MF772318，MF772319，MF772320，MF772321。說明所采集的樣品中確實含有PRSV、CMV、CGMMV和WTGs，證實了小RNA深度測序結果的可靠性。

2.4 中國南瓜曲葉病毒海南分離物的全基因組測序分析

經(jīng)過PCR驗證發(fā)現(xiàn)，WTGs在4個樣品中存在，選取P-CJ樣品（昌江）進行DNA-A和DNA-B全序列測定，經(jīng)擴增、克隆、測序，獲得P-CJ DNA-A和DNA-B組分全長分別為2 735 bp（登錄號為MF062251）和2 722 bp（登錄號為MF062252）。DNA-A病毒鏈編碼AV1和AV2共2個ORF，互補鏈編碼AC1～AC5共5個ORF；DNA-B病毒鏈和互補鏈分別編碼BV1和BC1 2個ORF，ORF在基因組中的位置及編碼的氨基酸數(shù)量詳見表3。

經(jīng)Blast檢索發(fā)現(xiàn)，P-CJ樣品DNA-A和DNA-B與SLCCNV分離物的同源性最高，分別在89.2%～99.3%和79.1%～98.8%。為進一步明確P-CJ與NCBI上所有已公布全基因組的SLCCNV的進化關系，基于DNA-A全序列構建了系統(tǒng)關系樹（圖3），Tomoato pseudo-curly top virus（X84735）為外組，P-CJ與中國、越南、泰國、馬拉西亞、東帝汶、菲律賓樣品聚集在同一大的分支上，而印度、巴基斯坦的樣品聚集在另一分支上?；贒NA-B全序列構建的系統(tǒng)關系樹中（圖4），Abutilon mosaic Bolivia virus（HM585446）為外組，P-CJ與中國、越南的樣品聚集在同一分支上，而印度、巴基斯坦的樣品聚集在另一分支上。上述結果說明，從海南昌江南瓜上分離到的WTG是SLCCNV的一個分離物。

3 討論

病毒病是中國南瓜生產(chǎn)上的一類重要病害，本研究利用小RNA深度測序技術，從6個混合樣品建成的cDNA文庫池中測得CMV、PRSV、CGMMV和SLCCNV等4種病毒，這些病毒分屬4個科，即植物桿狀病毒科（Virgaviridae）、馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）、雙生病毒科（Geminiviridae）和雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）。經(jīng)PCR驗證，除P-LD樣品僅檢測到CMV存在外，其它5個樣品中均檢測到2種以上病毒存在，這與重慶、云南和黑龍江等地報道的一致[2-3]，多種病毒同時侵染同一株南瓜，可能是南瓜生產(chǎn)上病毒病害發(fā)生嚴重的主要原因。采用ELISA方法，筆者在2013～2014年采集的180份海南南瓜樣本中檢測到TMV、CMV和CGMMV等3種病毒[15]。本研究中除檢測到CMV和CGMMV外，還檢測到PRSV和SLCCNV，但未檢測到TMV，可能是由于小RNA深度測序中僅用了6個樣品的混合樣進行測序，樣品量少?？紤]到小RNA深度測序的成本，該方法不適合田間大規(guī)模病毒種類普查，下一步需要將ELISA、PCR和小RNA深度測序技術三者相結合，研究海南南瓜上各種病毒的侵染時期及其在不同地區(qū)的分布情況等。

根據(jù)NCBI和相關文獻報道，目前中國南瓜曲葉病毒自然寄主有南瓜、甜瓜、西葫蘆、黃瓜、苦瓜、冬瓜、佛手瓜等葫蘆科作物，主要分布在亞洲的中國（廣東、廣西、海南）、越南、泰國、馬來西亞、菲律賓、東帝汶、印度、巴基斯坦等國家[16-25]。從構建的系統(tǒng)關系樹（圖3、圖4）可以明顯看出，SLCCNV明顯分為2個大的分支，印度和巴基斯坦的分離物聚集在一個分支上，其它國家的聚集在另外一個分支，海南不同地區(qū)的南瓜、甜瓜上的所有分離物均聚集在同一小分支，廣東和廣西的分離物聚集在另一小分支。說明SLCCNV不同分離物存在明顯的地域性分布。

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