張秀春 武亞丹 張春微 王健華 余乃通 劉志昕

摘 要 由木薯褐色條斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和烏干達(dá)木薯褐色條斑病毒（Uganda Cassava brown steak virus，UCBSV）引起的木薯褐色條斑病毒病（CBSD）嚴(yán)重威脅著非洲木薯種植業(yè)的發(fā)展，且目前沒(méi)有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻譯和復(fù)制系統(tǒng)來(lái)完成基因組的翻譯及自身的復(fù)制，其中真核翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）是多種 RNA 病毒侵染植物的必需因子。eIF4E7是木薯編碼的eIF4E基因家族成員之一，本研究構(gòu)建該靶標(biāo)基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E7。本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合半定量RT-PCR的方法證明，該載體能高效沉默過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7中的eIF4E7基因在本生煙葉片中的表達(dá)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用 RNA技術(shù)干擾植物基因的病毒防治新策略奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 木薯；eIF4E7；干擾載體；本生煙瞬時(shí)表達(dá)；半定量RT-PCR；沉默效果

中圖分類號(hào) S435.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cassava（Manihot esculenta Grantz）production in large areas of Africa is severely affected by cassava brown streak disease（CBSD）which is caused by two virus species， cassava brown streak virus（CBSV）and Ugandan cassava brown streak virus（UCBSV）. At present， there is no effective strategy for preventing CBSD. To complete the translation and replicaiton of its genome， virus need to employ the translation and replication system of host. During virus infection plants eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）has been implicated a necessary factor for a variety of RNA viruses. Cassava eIF4E7 is one member of Cassava eIF4E family. At present study we develop a interfering construct p1300-Ca4E7 which targetting Cassava eIF4E7 gene and demonstrate the construct can interfere the expression of eIF4E7 gene efficiently by employing the N. Banthemiana transient expression system and the semi-quantitative RT-PCR as well. The result pave a way for further investigating the function of Cassava eIF4E7 during the infecton of CBSV and UCBSV. It also provide theoretical basis for the new strategy of anti-virus by targeting host genes with RNAi technology.

Key words Cassava（Manihot esculenta Crantz）； eIF4E7； interference vecter； N. Banthemiana Transient Expression System； semi-quantitative RT-PCR； interference Efficiency

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.015

木薯褐色條斑病毒?。–BSD）在烏干達(dá)等國(guó)家發(fā)生嚴(yán)重危害，導(dǎo)致減產(chǎn)30%～85%，主要癥狀表現(xiàn)為葉片發(fā)黃、枝條的皮上有褐色壞死、老枝條上出現(xiàn)褐色條紋、塊根褐色壞死。由于該病不僅導(dǎo)致減產(chǎn)，還使塊根不適于食用，已被視為比木薯花葉病毒病危害更大的病害，是熱帶非洲糧食安全的主要威脅之一。CBSD是由屬于Potyviridae科Ipomovirus屬的木薯褐色條斑病毒（Cassava brown steak virus，CBSV）和烏干達(dá)木薯褐色條斑病毒（UCBSV）引起的，它們都是單組分正鏈RNA病毒，通過(guò)單一開(kāi)放閱讀框表達(dá)產(chǎn)生一種多肽前體，可翻譯切割成10種成熟蛋白，自基因組5′起分別為P3、6K1、CI（helicase）、6K2、VPg、NIa-Pro、RdRp、CP、PIPO和P3[1]。

病毒由于擁有極小的基因組，需要借助植物的翻譯和復(fù)制系統(tǒng)來(lái)完成基因組的翻譯及自身的復(fù)制。植物寄主對(duì)病毒的敏感性取決于病毒蛋白與植物“易感基因”編碼蛋白之間的密切相互作用。任何打破病毒與植物編碼蛋白之間的相互作用都會(huì)導(dǎo)致寄主敏感性的喪失，從而對(duì)病毒感染產(chǎn)生抗性[2]。自然界中存在的隱性抗性基因，就是由于植物翻譯和復(fù)制系統(tǒng)中相關(guān)蛋白因子的功能喪失或者以病毒不能識(shí)別的方式存在，病毒無(wú)法在寄主體內(nèi)完成增殖，致使植株獲得對(duì)病毒的抗性。馬鈴薯Y病毒（Potyviruses）的研究結(jié)果顯示，大部分隱性抗病基因是轉(zhuǎn)錄起始因子（eIF4E）基因家族的等位基因。由于少數(shù)關(guān)鍵位點(diǎn)變異，病毒的基因組連接蛋白（VPg）無(wú)法識(shí)別并與其相互作用，導(dǎo)致病毒不能復(fù)制，從而對(duì)病毒產(chǎn)生免疫力。利用基因工程手段敲除或突變寄主eIF4E類因子可以使番茄、甜瓜等作物獲得對(duì)CVYV、MNSV等馬鈴薯Y病毒的抗性[3-6]，也進(jìn)一步證明寄主eIF4E類因子對(duì)馬鈴薯Y病毒侵染復(fù)制的重要性。

前期研究發(fā)現(xiàn)，木薯eIF4E7與CBSV及UCBSV的VPg蛋白均發(fā)生互作，說(shuō)明它們很可能在CBSV及UCBSV侵染中起關(guān)鍵作用。RNA沉默又稱RNA干擾（RNAi），是指在真核生物中，雙鏈RNA專一的RNaseIII家族核酸內(nèi)切酶——Dicer或Dicer-like（簡(jiǎn)稱DCL）剪切雙鏈RNA或部分雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生20 nt左右的siRNA（small interference RNA），然后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，簡(jiǎn)稱RISCs），利用RNA序列匹配，專一地識(shí)別靶標(biāo)基因，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的現(xiàn)象[7]。本研究構(gòu)建靶標(biāo)木薯eIF4E7基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E7，并利用本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合半定量RT-PCR證明該載體能有效地干擾木薯eIF4E7基因，為研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通過(guò)RNAi技術(shù)培育抗多個(gè) CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種）奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 RNAi克隆載體p18TRNAi和經(jīng)改造后的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300分別由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所于曉玲副研究員和阮孟斌副研究員提供。質(zhì)粒pGBKT7-eIF4E7、pAI-ALSV、大腸桿菌DH5α菌株和農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 植物材料 本生煙（Nicotiana Banthemiana）由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，以26～28 ℃光照培養(yǎng)，每日光照培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度為1 500 lx。待植株長(zhǎng)至5～6葉期時(shí)注射農(nóng)桿菌。

1.1.3 酶與試劑 各種限制性內(nèi)切酶、Prime STARR Max DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、PCR Mix均購(gòu)自TaKaRa公司，Gibson AssemblyR Master Mix購(gòu)自NEW ENGLAND BioLabs公司，TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）購(gòu)自TIANGEN生物技術(shù)公司，研究中所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 干擾片段的選擇 登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說(shuō)明書(shū)對(duì)木薯eIF4E7基因（013732m，https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進(jìn)行分析，選取eIF4E7基因第340～656 bp為干擾片段，該區(qū)域包含軟件分析的最有可能產(chǎn)生小RNA的前2個(gè)序列。

1.2.2 正反義干擾片段的擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化及重組子的PCR鑒定 根據(jù)從eIF4E7基因中所選取的干擾片段設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)如表1所示。為采用Gibson Assembly技術(shù)構(gòu)建載體，引物前端添加擬連接載體序列（黑體加粗）。G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC用于擴(kuò)增反義插入片段Ca4E7R，G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX用于擴(kuò)增正義片段Ca4E7F。以pGBKT7-eIF4E7為模板，PCR擴(kuò)增體系為：5 ng/μ DNA模板1 μL，PrimeSTARR Max Buffer 5 μL（10×），dNTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1 μL，PrimeSTARR HS DNA Polymerase 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積50 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 8 s， 55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 利用Gibson Assembly技術(shù)構(gòu)建RNAi克隆載體 利用Gibson Assembly技術(shù)將擴(kuò)增片段Ca4E7R與經(jīng)EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切回收的p18TRNAi大片段連接，具體操作按NEW ENGLAND BioLabs公司Gibson AssemblyR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定引物為Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC；對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定后再進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定正確的克隆載體命名為pRNAiCa4E7R。pRNAiCa4E7R經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收大片段，采用Gibson Assembly技術(shù)將大片段與用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物Ca4E7F連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物為G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX；用EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆進(jìn)行酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確、含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的克隆載體命名為pRNAiCa4E7。PCR擴(kuò)增體系均為：稀釋質(zhì)粒1 μL，PCR Mix 15 μL（2×），上游和下游引物各0.6 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積30 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃，30 s 56 ℃，30 s 72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.4 RNAi載體p1300-Ca4E7構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將表達(dá)載體pCAMBIA1300與pRNAiCa4E7經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，分別回收大小片段進(jìn)行連接，具體參照T4 DNA Ligase試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，鑒定引物為G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX，反應(yīng)條件同1.2.3；將經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。采用熱擊法將p1300-Ca4E7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)PCR鑒定正確后用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

1.2.5 過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 以pGBKT7-eIF4E7為模板，G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX為引物擴(kuò)增eIF4E7基因，采用Gibson Assembly的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物eIF4E7與經(jīng)XbaⅠ和 XhoⅠ雙酶切回收的pAI-ALSV大片段連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，鑒定引物為G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX，反應(yīng)條件同1.2.3；將PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的eIF4E7基因過(guò)量表達(dá)載體命名為pAI-Ca4E7；采用熱擊法將pAI-Ca4E7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)PCR鑒定正確后用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá) 將含有eIF4E7基因過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7、RNAi載體p1300-Ca4E7或表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌放在YEB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素、鏈霉素和利福平各50 μg/mL）中，以28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)24 h；取50 μL菌液至5 mL上述YEB液體培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用MMA溶液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 μmol/L AS）重懸菌體至OD600=1.0，靜置誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后經(jīng)注射接種至5～6葉期的本生煙葉片，每個(gè)處理重復(fù)接種10片葉；將注射后的植物于26～28 ℃中光照培養(yǎng)，每日光照培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度為1 500 lx。

1.2.7 半定量RT-PCR檢測(cè)沉默效果 （1）半定量引物合成。為檢測(cè)RNAi載體的干擾效果，使用Primer Premier 5（version 5.00）軟件設(shè)計(jì)木薯eIF4E7檢測(cè)引物Ca4E7-265F和Ca4E7-669R；并選用本生煙肌動(dòng)蛋白（Actin） mRNA為內(nèi)標(biāo)，設(shè)計(jì)引物NbACT-247F、NbACT-780R，用以消除不同樣品間模板量的差異。具體引物序列見(jiàn)表1。

（2）半定量檢測(cè)。分別在注射農(nóng)桿菌后第4天（4dpi）、第5天（5dpi）和第6天（6dpi）收集本生煙葉片。為減少由于實(shí)驗(yàn)操作造成的樣品誤差，注射后的葉片只取半片，每10半片葉混在一起提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別按TIANGEN生物技術(shù)公司的TRIzolR Reagent、FastQuant RT Kit（with gDNase）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

將上述所得cDNA進(jìn)行間隔3倍的梯度稀釋，以NbACT-247F和NbACT-780R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：不同稀釋濃度的cDNA 4 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，NbACT-247F和NbACT-780R各0.5 μL（10 μmol/L），補(bǔ)ddH2O至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，31個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

取與內(nèi)標(biāo)NbActin擴(kuò)增大體一致的樣品進(jìn)行eIF4E7表達(dá)量分析，以Ca4E7-265F和Ca4E7-669R為引物，PCR擴(kuò)增體系和條件均與內(nèi)標(biāo)相同。以上每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆載體pRNAiCa4E7R的構(gòu)建

用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC擴(kuò)增反義插入片段Ca4E7R，獲得大于250 bp（圖1泳道1）的條帶，擴(kuò)增大小與預(yù)期結(jié)果一致。將目的片段過(guò)柱回收后與p18TRNAi經(jīng)EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切回收的大片段連接，構(gòu)建含反義插入片段的克隆載體pRNAiCa4E7R。用引物G-Ca4E7-364FE和G-Ca4E7-656RC對(duì)pRNAiCa4E7R進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖1泳道2）與目的片段Ca4E7R大小一致。用EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)pRNAiCa4E7R進(jìn)行雙酶切鑒定，所得酶切片段比對(duì)照p18TRNAi小（圖2泳道1），約為500 bp（圖2泳道2），與預(yù)期大小一致；測(cè)序結(jié)果表明，克隆載體pRNAiCa4E7R的插入片段序列與網(wǎng)上公布的序列一致。以上鑒定結(jié)果表明，含反義插入片段的pRNAiCa4E7R克隆載體構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 克隆載體pRNAiCa4E7的構(gòu)建

用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX擴(kuò)增反義插入片段Ca4E7F，獲得大于250 bp（圖1泳道3）的條帶，擴(kuò)增大小與預(yù)期結(jié)果一致。將目的片段過(guò)柱回收后與pRNAiCa4E7R經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的大片段連接，構(gòu)建含正反義插入片段、形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的克隆載體pRNAiCa4E7。用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX對(duì)pRNAiCa4E7進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖1泳道4）與目的片段Ca4E7F大小一致；用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期一致、大于500 bp的片段（圖2泳道3）；測(cè)序結(jié)果表明，克隆載體pRNAiCa4E7的正義插入片段序列與網(wǎng)上公布的序列一致。以上鑒定結(jié)果表明，含正反義插入片段、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的克隆載體pRNAiCa4E7構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 RNAi載體p1300-Ca4E7構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

表達(dá)載體pCAMBIA1300與pRNAiCa4E7經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，分別回收大小片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。含Kan抗性平板上的克隆用引物G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖1泳道5）與目的片段Ca4E7F大小一致；待鑒定質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，切下與克隆載體pRNAiCa4E7大小相同的片段（圖2泳道4與泳道3），說(shuō)明RNAi載體構(gòu)建成功，命名為p1300-Ca4E7。采用液氮冷激法將p1300-Ca4E7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-340FB和G-Ca4E7-656RX進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖1泳道6）與目的片段Ca4E7F（圖1泳道3）大小一致，說(shuō)明p1300-Ca4E7已被成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌，形成工程菌，可用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

2.4 過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道2）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致；用XbaⅠ和XhoⅠ對(duì)pAI-Ca4E7進(jìn)行雙酶切鑒定，切下的小片段與預(yù)期大小一致；由于插入基因ALSV內(nèi)部有1個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)，從載體pAI-ALSV切下2個(gè)小片段（圖4泳道1與泳道2）。鑒定結(jié)果表明eIF4E7基因已插入到pAI表達(dá)載體，命名為pAI-Ca4E7；經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證可知過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7構(gòu)建成功。采用液氮冷激法將pAI-Ca4E7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，用G-Ca4E7-1FX和G-Ca4E7-687RX進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶（圖3泳道3）與目的片段eIF4E7（圖3泳道1）大小一致，說(shuō)明pAI-Ca4E7已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌，形成了工程菌，可用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

2.5 半定量RT-PCR檢測(cè)沉默效果

為檢測(cè)RNAi載體的沉默效果，分別提取注射農(nóng)桿菌后4dpi、5dpi和6dpi的本生煙葉片RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，在采用本生煙NbActin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)調(diào)整樣品cDNA濃度基本一致的情況下（圖5），注射農(nóng)桿菌后4dpi，單獨(dú)注射過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7或與表達(dá)載體pCAMBIA1300共同注射的樣品表達(dá)量基本一致，而單獨(dú)注射農(nóng)桿菌的樣品檢測(cè)不到木薯eIF4E7基因的表達(dá)，說(shuō)明木薯eIF4E7基因在注射后4dpi能在本生煙中高效瞬時(shí)表達(dá)。但是，過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7與干擾載體p1300-Ca4E7共同注射的樣品只檢測(cè)到微量的木薯eIF4E7基因表達(dá)。注射后5dpi、6dpi的表達(dá)情況與注射后4dpi的基本相同。由于干擾載體p1300-Ca4E7與表達(dá)載體pCAMBIA1300的大片段是相同的，區(qū)別僅在于干擾載體p1300-Ca4E7含有木薯eIF4E7基因部分片段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而表達(dá)載體pCAMBIA1300的插入片段為sGFP，說(shuō)明木薯eIF4E7基因的表達(dá)量減少是由干擾載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)引發(fā)的基因沉默造成的，所構(gòu)建的木薯eIF4E7基因RNA干擾載體在體外能有效干擾靶標(biāo)基因。此外，注射后6dpi過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7不論單獨(dú)注射還是與表達(dá)載體pCAMBIA1300共同注射，木薯eIF4E7基因的表達(dá)量均有所降低，說(shuō)明這是由于植物自身的RNAi效果引發(fā)的。

3 討論

隱性抗病基因在植物抗病毒中是普遍存在的，目前已有很多實(shí)例顯示隱性抗病基因能夠控制重要的農(nóng)業(yè)病毒，尤其是對(duì)馬鈴薯Y病毒屬病毒，其隱性抗病基因占抗性基因的40%。目前發(fā)現(xiàn)的隱性抗病基因有mo1（萵苣）、nsv（甜瓜）、pot-1（野生馬鈴薯）、pvr1、pvr2、pvr6和pvr2（辣椒）、rym4、rym5和rym6（大麥）、sbm1、wlv和cyv2（豌豆）、va1和va2（煙草）、Isp1-1、Isp1-2和 Isp1-3（擬南芥），tsv1和rymv-1（水稻）等，分別對(duì)不同種病毒產(chǎn)生抗性，研究證明這些抗病毒基因大部分是eIF4E家族等位基因，它們之間僅少數(shù)位點(diǎn)有差異[8-9]。

前期研究發(fā)現(xiàn)木薯編碼的eIF4E基因家族成員013732m（本文中命名為eIF4E7）與CBSV及UCBSV的VPg蛋白的均發(fā)生互作（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），說(shuō)明它們很可能在CBSV及UCBSV侵染中起關(guān)鍵作用。為深入研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及通過(guò)RNAi技術(shù)培育獲得抗多個(gè)CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種），本研究構(gòu)建靶標(biāo)木薯eIF4E7基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E7，并利用本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合半定量RT-PCR對(duì)其干擾效果進(jìn)行研究。

由于木薯轉(zhuǎn)化工作不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且難度比較大[10]，因此很有必要在用于轉(zhuǎn)化木薯之前鑒定所構(gòu)建的RNAi載體是否能有效地沉默靶標(biāo)基因。為檢測(cè)干擾載體p1300-Ca4E7的沉默效果，本研究采用本生煙瞬時(shí)表達(dá)結(jié)合半定量RT-PCR的方法，構(gòu)建了木薯eIF4E7基因的過(guò)量表達(dá)載體pAI-Ca4E7，并利用農(nóng)桿菌注射法將其單獨(dú)或與干擾載體p1300-Ca4E7一起轉(zhuǎn)入本生煙葉片中表達(dá)。半定量RT-PCR分析表明注射后第4天表達(dá)載體pAI-Ca4E7能在本生煙葉片中高效表達(dá)eIF4E7基因，但將pAI-Ca4E7與干擾載體p1300-Ca4E7一起注射后eIF4E7基因的表達(dá)量明顯降低，說(shuō)明構(gòu)建的木薯eIF4E7基因RNA干擾載體能有效沉默靶標(biāo)基因。與文獻(xiàn)報(bào)道的方法（利用轉(zhuǎn)化體系成熟的植物如擬南芥[11]、煙草[12]、水稻[13]等，或?qū)朐|(zhì)體后再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)[14]）比較，本研究采用的RNAi載體沉默效果檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏等特點(diǎn)。注射農(nóng)桿菌后第4天便可進(jìn)行檢測(cè)，而轉(zhuǎn)化體系成熟的模式植物獲得轉(zhuǎn)基因植物至少也需要3個(gè)月的時(shí)間；利用原生質(zhì)體時(shí)間雖然相對(duì)短，但原生質(zhì)體的制備還是比較困難。本研究構(gòu)建高效沉默該基因的RNAi載體，為研究木薯eIF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用及通過(guò)RNAi技術(shù)培育獲得抗多個(gè)CBSV及UCBSV病毒株的木薯品系（或品種）奠定基礎(chǔ)。

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