于海芹　饒思蓮　趙丹陽　劉勇　李永平

摘要：[目的]系統(tǒng)了解煙草種質(zhì)資源T1203抗煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的特點，為煙草抗病育種的親本選擇提供更豐富信息。[方法]以煙草種質(zhì)資源T1203為材料，采用TMV病毒接種、病情調(diào)查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復(fù)制水平測定及日灼現(xiàn)象觀察等方法，研究T1203對TMV的抗性特異性、T1203接種TMV普通株系（TMV-U1株系）后的癥狀、病毒復(fù)制水平等。[結(jié)果]T1203只對TMV表現(xiàn)無癥狀的抗病特點，接種馬鈴薯Y病毒（PVY）和黃瓜花葉病毒（CMV）則表現(xiàn)出典型癥狀。接種TMV-Ul株系后14d，Western blotting檢測結(jié)果顯示，T1203葉片病毒復(fù)制水平明顯低于對照品種；用表達GFP的TMV侵染性克隆浸潤接種發(fā)現(xiàn)，T1203對TMV的抗性發(fā)生在病毒復(fù)制水平。在高溫和強日照條件下，T1203生長迅速的中上部葉片會發(fā)生日灼現(xiàn)象，且難以恢復(fù)。[結(jié)論]T1203只對TMV表現(xiàn)無癥狀，其對TMV的抗性發(fā)生在病毒復(fù)制水平。

關(guān)鍵詞：煙草種質(zhì)；T1203；煙草花葉病毒（TMV）；抗病性

中圖分類號：S286.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2004-06

0引言

[研究意義]煙草花葉病毒病是我國煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大侵染性病害前茅（劉勇等，2006），種植抗病品種是防控?zé)煵莼ㄈ~病于海芹等：煙草種質(zhì)資源T1203對煙草花葉病的抗性特點毒（Tobacco mosaic virus，TMV）最經(jīng)濟、有效的手段（許石劍等，2009）。研究表明，烤煙品種TMV抗性由一個顯性單基因州空制，N基因來源于煙草野生種心葉煙（Nicotiana glutinosa）（Holmes，1960），通過一系列的回交轉(zhuǎn)育和常規(guī)雜交，心葉煙中包含N基因的染色體片段轉(zhuǎn)育至香料煙中，然后轉(zhuǎn)育至白肋煙和烤煙品種中（Chaplin and Gooding，1969；Chaplinand Mann，1978；Beekwilder，1999）。雖然Ⅳ基因可有效抑制TMV的復(fù)制和傳播，但包含Ⅳ基因的染色體片段存在與Ⅳ基因高度連鎖控制不利性狀的基因，不利性狀表現(xiàn)為相對較低的產(chǎn)量、貪青晚熟等，限制了包含Ⅳ基因的種質(zhì)資源在育種中的使用。因此，有必要尋找新的抗TMV種質(zhì)資源，以便提高煙草的TMV抗性且無不利性狀。[前人研究進展]Nolla和Roque于1933年在哥倫比亞研究發(fā)現(xiàn)，無Ⅳ基因煙草種質(zhì)Ambalema接種TMV后無感染TMV的典型癥狀，但可檢測到少量病毒。后來Valleau（1952）將Ambalema的抗病類型稱為無癥狀（Symptomless）。1969年Chaplin和Goodling在對907份煙草資源接種TMV進行抗性鑒定時發(fā)現(xiàn)，除了常見的過敏性壞死反應(yīng)抗病表型和花葉癥狀外，還發(fā)現(xiàn)更多煙草種質(zhì)表現(xiàn)無癥狀。陳海如和范靜華（1991）報道，煙草種質(zhì)Ambalema接種TMV后表現(xiàn)無癥狀，但從植株各葉齡葉片上均能檢測出TMV。Beekwilder（1999）將從無癥狀葉片中提取的汁液接種到TMV枯斑寄主上，3-7d后接種葉出現(xiàn)壞死斑，證明無癥狀個體雖然肉眼看不出明顯的感病癥狀，但葉片中存在TMV。Yuan等（2015）報道了幾種在接種TMV后表現(xiàn)為無癥狀的野生煙草，包括Ⅳcavicola（PI 271990）、N.glauca（PI 282690）、N.noctiflora（PI 417918）、N.af-ricana（PI 555472）、N.benavidesii（PI 555477）和N.raimondii（PI 555549）。這種無癥狀表型可看成一種抗病反應(yīng)，有的文獻將T1203和Ambalema等無癥狀資源視為抗TMV資源（Beekwilder，1999）。胡群（2016）研究表明，T1203等煙草品種對TMV的無癥狀表型是由兩個拷貝的隱性基因控制，控制無癥狀基因的克隆可促進此類資源在育種中的利用。[本研究切入點]T1203是我國引進的高抗TMV種質(zhì)資源，其對TMV侵染表現(xiàn)無癥狀，可應(yīng)用于煙草的抗TMV育種。雖然前人對無癥狀煙草種質(zhì)資源已有一些研究，但針對T1203資源的系統(tǒng)研究未見文獻報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]通過TMV接種、病情調(diào)查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復(fù)制水平測定及日灼現(xiàn)象觀察等探究煙草種質(zhì)資源T1203的TMV抗性特點，以期為煙草抗病育種的親本選擇提供更豐富的信息。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試煙草品種：T1203（無癥狀表型品種）、Coker176（高抗品種）、K326（普通煙對照）和中煙100（感病對照）。毒源：TMV-U1株系（TMV-U1）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和表達GFP的TMV侵染性克隆。

1.2試驗方法

1.2.1病毒接種與病情調(diào)查 在溫室內(nèi)按常規(guī)方法漂浮育苗，苗齡50d左右，在小花盆中每份定植18株，每盆1株，采用棉簽?zāi)Σ两臃N病毒。具體方法：采集經(jīng)免疫檢測試紙條檢測無污染的毒源新鮮病葉，于無菌研缽中用接種緩沖液（0.01mol/LpH7.0磷酸鹽緩沖液）研磨，雙層紗布過濾，調(diào)整接種液濃度為1：100（重量體積比，g/L），在病毒汁液中加入過0.075mm篩孔的1%SiO₂；用棉簽取病葉汁液，每株摩擦接種2片葉。接種后第5和7d以株為單位調(diào)查接種葉是否有枯斑；接種后10、14、21、28、35和40d調(diào)查花葉等癥狀發(fā)生情況。

試紙條檢測法：采用Agdia公司（www.agdia.com）的TMV檢測試紙條（Imuno-strip）進行檢測，方法參考試劑說明書。

1.2.2病毒外殼蛋白累計量檢測 參照于翠（2004）的方法，利用TMV和CMV的外殼蛋白單克隆抗體，檢測接種病毒后煙草葉片中的病毒外殼蛋白累積量。

1.2.3TMV復(fù)制水平測定 參照Donson等（1991）的方法，將表達GFP的TMV侵染性克隆導(dǎo)人農(nóng)桿菌菌株EHAl05，將農(nóng)桿菌稀釋500倍浸潤接種5葉期的普通煙對照K326和T1203下部葉片，并在熒光顯微鏡下觀察浸潤葉片重組病毒中GFP的表達情況。參照Yu等（2004）的方法分別制備T1203和K326的葉片原生質(zhì)體細胞，利用TMV侵染性體外轉(zhuǎn)錄本，通過電極法轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，2d后Trizol法提取原生質(zhì)體總RNA，設(shè)計TMV特異性引物進行熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）測定TMV基因組復(fù)制水平；以煙草Actin基因為內(nèi)參基因。

1.2.4日灼現(xiàn)象觀察 常規(guī)方法田間移栽T1203和K326，每份材料移栽20株。觀察煙草植株的生長情況及葉片在強日照天氣下是否出現(xiàn)萎蔫和枯死。

2結(jié)果與分析

2.1T1203接種TMV后葉片癥狀及病毒檢測結(jié)果

塑料大棚內(nèi)盆栽T1203、Coker176、K326和中煙100苗期接種TMV-U1株系，高抗TMV的枯斑資源Cokerl76在接種5d后其接種葉片表現(xiàn)枯斑，持續(xù)調(diào)查至接種后40d，非接種葉無癥狀（表1）；K326和中煙100接種后14d開始表現(xiàn)典型花葉，接種后第28d植株明顯矮化（圖1），接種40d后上部非接種葉表現(xiàn)典型花葉、畸形和矮化等癥狀（圖2）；T1203接種TMV后14d葉片無癥狀表現(xiàn)，接種后28d亦無花葉、畸形和矮化等癥狀，上部非接種葉TMV免疫試紙條檢測為TMV陽性，接種后第40d非接種葉表現(xiàn)輕微的黃色斑駁（表1、圖1和圖2）。

2.2抗性特異性檢測及病毒外殼蛋白積累量檢測結(jié)果

為檢驗T1203是否對侵染煙草的PVY和CMV表現(xiàn)癥狀，在光照培養(yǎng)室內(nèi)分別采用摩擦接種TMV、PVY和CMV，結(jié)果顯示，接種TMV后14d，對照普通煙K326全部表現(xiàn)花葉，T1203無癥狀；接種PVY和CMV后14d，K326和T1203均表現(xiàn)明顯的花葉、葉片狹窄等典型癥狀（未列出圖片）。表明T1203對TMV的無癥狀表型具有特異性。

光照培養(yǎng)室內(nèi)接種后14d，利用TMV單克隆抗體對非接種葉片的TMV外殼蛋白（CP）積累量進行檢測，結(jié)果表明，T1203葉片中TMV-CP含量明顯低于對照K326；利用CMV單克隆抗體對非接種葉片的CMV外殼蛋白（CP）積累量進行檢測，結(jié)果表明，T1203葉片中CMV-CP含量與對照K326相當（圖3）。非接種葉病毒外殼蛋白積累量檢測結(jié)果顯示，光照培養(yǎng)室內(nèi)接種后14d，T1203葉片中TMV病毒積累量較對照K326低，與無癥狀表型吻合；T1203葉片中CMV病毒積累量與對照K326相當，與花葉癥狀表型吻合（未列出圖片）。

2.3TMV復(fù)制水平測定結(jié)果

為明確T1203抗TMV的機理，利用表達GFP的TMV侵染性克隆分析抗性發(fā)生水平，該侵染性克隆不能系統(tǒng)侵染普通煙，僅可在浸潤細胞內(nèi)復(fù)制（Don-son et a1.，1991）。表達GFP的TMV侵染性克隆浸潤接種7和10 d后，K326的浸潤葉可觀察到離散的綠色熒光，而T1203浸潤葉未觀察到綠色熒光（圖4），說明T1203對TMV的抗性水平發(fā)生在病毒復(fù)制水平。利用TMV侵染性體外轉(zhuǎn)錄本，通過電極法轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，然后通過定量PCR測定原生質(zhì)體中TMV負鏈基因組RNA積累水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1203原生質(zhì)體中TMV的復(fù)制量僅為K326的20%（圖5），進一步驗證T1203對TMV的抗性發(fā)生在病毒復(fù)制水平。

2.4日灼現(xiàn)象觀察結(jié)果

T1203在25℃以上的強光照射下，生長迅速的上部新展開葉易發(fā)生日灼現(xiàn)象，表現(xiàn)為葉片上部萎蔫，隨后萎蔫部位枯死。K326等感TMV對照品種偶爾表現(xiàn)上部葉片萎蔫的日灼癥狀，但萎蔫癥狀大部分能恢復(fù)（圖6）。

3討論

近年來，針對T1203等無癥狀資源的研究較少。陳海如和范靜華（1991）研究了病毒在T1203不同葉齡葉片中的分布情況，胡群（2016）對控制T1203無癥狀表型的基因進行研究，而本研究通過TMV病毒接種、病情調(diào)查、病毒外殼蛋白累計量檢測、TMV復(fù)制水平測定及日灼現(xiàn)象觀察等分析T1203對TMV的抗性特異性、T1203接種TMV普通株系（TMV-U1株系）后的癥狀、病毒復(fù)制水平等，更系統(tǒng)地探究了煙草種質(zhì)資源T1203抗TMV的特點，為煙草抗病育種的親本選擇提供了更豐富的信息。

本研究苗期接種試驗結(jié)果顯示，T1203接種TMV-U1株系早期（接種后28d內(nèi)）葉片無枯斑、花葉和斑駁等明顯癥狀，因此被稱為無癥狀抗病類型。T1203接種TMV-U1株系的無癥狀表型受接種后時間、光照和溫度等影響，接種后28d內(nèi)T1203表現(xiàn)為無癥狀；接種后28d開始，在較高溫度和光照條件下，T1203幼嫩葉片表現(xiàn)輕微的黃色斑駁癥狀，但煙株無花葉、畸形和矮化等癥狀。與感病的K326典型TMV癥狀相比較，T1203的癥狀輕微，K326未感染TMV的煙株幼嫩葉片有時也表現(xiàn)輕微的黃色斑駁，因此，由于肉眼觀察的局限性，T1203接種后期幼嫩葉片輕微的黃色斑駁癥狀可能被忽視。本研究結(jié)果表明，T1203的無癥狀現(xiàn)象對TMV具有特異性，對PVY和CMV無此現(xiàn)象發(fā)生。Chaplin和Gooding（1 969）發(fā)現(xiàn)T125、T1383、T1384、T1407、T1410、T1411、T1412、T1413、T1436、T1437、T1438、T1439、T1448、T1448A、T1449、T1450、T1465、T1468、T1470、T1471、T1692、T11203和T11467等25份煙草資源對TMV表現(xiàn)無癥狀，這些資源被稱為Ambalema類抗TMV資源。胡群（2016）研究表明，T1203對TMV的無癥狀表型由2個拷貝的隱性基因控制，且T1203非接種葉片中的TMV含量較低。病毒復(fù)制水平低和病毒移動出接種葉受阻均可導(dǎo)致非接種葉中病毒含量低。本研究病毒侵染性克隆浸潤接種、原生質(zhì)體病毒RNA含量檢測結(jié)果表明，非接種葉病毒含量低很可能發(fā)生在病毒復(fù)制水平。鑒于接種TMV表現(xiàn)無癥狀的資源葉片內(nèi)存在較低濃度的TMV，建議將此類資源稱為耐病資源（Disease tolerance），以便與常見的抗病性相區(qū)分。

研究中發(fā)現(xiàn)T1203較K326等對照易發(fā)生日灼現(xiàn)象。Valleau（1952）研究發(fā)現(xiàn)Ambalema有隱癥現(xiàn)象，高溫時也會出現(xiàn)日灼現(xiàn)象，且難以恢復(fù)；Nolla和Roque等（1933）研究發(fā)現(xiàn)Ambalema接種TMV后有空莖現(xiàn)象，但是否屬于隱癥現(xiàn)象的并發(fā)癥還有待進一步研究。

T1203接種TMV后，前期表現(xiàn)為無癥狀且葉片病毒累積量低、后期非接種幼葉表現(xiàn)輕微的黃色斑駁癥狀、高溫和強日照條件下容易出現(xiàn)不可恢復(fù)的日灼現(xiàn)象，這些特點限制了T1203這類無癥狀資源作為抗TMV資源的育種利用。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，煙草種質(zhì)資源T1203只對TMV表現(xiàn)無癥狀的抗病特點，接種PVY和CMV表現(xiàn)典型感病癥狀，且T1203對TMV的抗性發(fā)生在病毒復(fù)制水平。在高溫和強日照條件下，T1203生長迅速的中上部葉片會發(fā)生日灼現(xiàn)象，且難以恢復(fù)。

（責(zé)任編輯麻小燕）