黃雅琴

摘要：[目的]分析微波輻照對蠶豆種子萌發(fā)、花粉發(fā)育及農(nóng)藝性狀的影響，明確微波輻照對植物的輻射效應(yīng)，為微波輔助作物育種提供理論參考。[方法]分別以0（對照，CK）、5、10、15、20、25和30s微波爐輻照處理蠶豆干種子，分析不同微波輻照時(shí)間對蠶豆的種子萌發(fā)、花粉發(fā)育及農(nóng)藝性狀的影響。[結(jié)果]微波輻照處理的蠶豆種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均隨著輻照時(shí)間的延長呈先上升后下降的變化趨勢，說明適當(dāng)?shù)奈⒉ㄝ椪漳艽龠M(jìn)種子萌發(fā)。微波輻照處理的蠶豆花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期均能觀察到6種類型的染色體畸變，且隨著輻照時(shí)間的延長，染色體畸變類型增多，染色體總畸變率升高，表明輻照時(shí)間和染色體畸變呈顯著正相關(guān)（r=0.8432）（P<0.05，下同）。微波輻照的蠶豆花粉可育率隨著輻照時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢，表明微波輻照阻礙花粉正常發(fā)育，微波輻照時(shí)間與花粉可育率呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.9066）。微波輻照5、10和15s的蠶豆株高、節(jié)數(shù)、葉面積和單株葉片數(shù)目與CK均無顯著差異（P>0.05）；微波輻照20s的蠶豆株高和單株葉片數(shù)目均顯著高于CK；微波輻照25s的蠶豆株高顯著高于CK，葉面積顯著低于CK；微波輻照30s的蠶豆葉面積極顯著低于CK，單株葉片數(shù)目顯著低于CK。即微波輻照20s能促進(jìn)蠶豆植株長高，增加單株葉片數(shù)，但輻照時(shí)間進(jìn)一步延長，株高、葉面積和單株葉片數(shù)又逐漸降低。[結(jié)論]微波輻照是一種有效的選育手段，適當(dāng)微波輻照能提高蠶豆種子的萌發(fā)率，改善蠶豆的農(nóng)藝性狀。但微波輻照能誘發(fā)蠶豆花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生染色體畸變，導(dǎo)致花粉敗育。

關(guān)鍵詞：蠶豆；微波輻照；發(fā)芽率；減數(shù)分裂；染色體畸變；農(nóng)藝性狀

中圖分類號：S643.603.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-1948-06

0引言

[研究意義]微波輻射是一種低能電磁輻射，可引起生物體的系統(tǒng)損傷與紊亂（Wang et a1.，2012；Westhoff et a1.，2013），誘發(fā)植物數(shù)量l生狀變異，輔助作物育種（方興等，1994；賈紅華等，2003；Garai-Vrhovac et a1.，2009）。應(yīng)用微波輻射技術(shù)可創(chuàng)造出新材料與新種質(zhì)，以彌補(bǔ)常規(guī)育種方法的不足，且不存在安全隱患（朱宗文等，2010），但研究微波輻射對作物產(chǎn)生的影響是首要工作，對新品種選育具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]至今，已有大量研究證實(shí)，蠶豆的染色體對外界各種致突變因子非常敏感，可引起染色體嚴(yán)重畸變（Ghatnekar，1964；Dimeska eta1.，2010；Sharma et a1.，2009；歐陽裕元等，2016），導(dǎo)致農(nóng)藝性狀改變。湯澤生等（1980）、Sharma等（2009）研究表明，隨著輻射劑量的增加，蠶豆花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體畸變率升高。華勁松等（2005）以⁶⁰Co-γ射線處理蠶豆干種子，發(fā)現(xiàn)蠶豆M₁代的生育期、生物學(xué)性狀和光合生理均有明顯影響。王昆林等（2008）以激光輻射蠶豆根尖細(xì)胞，導(dǎo)致根尖細(xì)胞有絲分裂活性增強(qiáng)，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。羅蔚華等（2012）以微波輻射蠶豆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著輻射時(shí)間的延長，微核率及染色體畸變率逐漸升高。胡旭群等（2015）通過⁶⁰Co-γ射線對大粒鮮食蠶豆進(jìn)行誘變，有效改善了原始品種的農(nóng)藝性狀。[本研究切入點(diǎn)]目前，關(guān)于微波輻射對蠶豆的誘變效應(yīng)研究主要集中在根尖有絲分裂方面（劉文魁和王鳳，1994；羅蔚華等，2012），僅證實(shí)其可引起根尖細(xì)胞發(fā)生變異，但生殖細(xì)胞是否發(fā)生變異尚不清楚。[擬解決的關(guān)鍵問題]以微波輻照蠶豆種子，分析不同輻照時(shí)間對蠶豆種子萌發(fā)、花粉發(fā)育及農(nóng)藝性狀的影響，為研究微波輻照的生物學(xué)效應(yīng)及誘變育種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試蠶豆購自信陽市東關(guān)農(nóng)貿(mào)市場，大小勻稱，色澤一致，無病蟲害。微波源為格蘭仕微波爐[型號G70D20CN1L-M1（S0）]，額定電壓額定功率220 V-0 Hz，微波1180 w，額定微波頻率2450 MHz。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1微波輻照處理 將蠶豆干種子分成7組，每組50粒，分別用微波爐輻照處理0（對照，CK）、5、10、15、20、25和30s，每組3次重復(fù)。

1.2.2種子萌發(fā) 將微波輻射照處理的7組蠶豆種子消毒后浸泡1d，以胚根突破種皮為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，于第3d計(jì)算發(fā)芽勢（第3d發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率），第7d發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率（最終發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率）。

1.2.3染色體畸變觀察 將發(fā)芽的蠶豆苗種植于試驗(yàn)田中，進(jìn)行常規(guī)田間管理。待其長出花蕾，采集減數(shù)分裂旺盛的幼嫩花蕾，按照常規(guī)方法固定漂洗，以改良卡寶品紅染液染色3～5min，分散壓平后置于顯微鏡下觀察染色體畸變情況，每處理組至少觀察1000個(gè)減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行記錄及拍照。常見的染色體畸變有微核、染色體橋、染色體斷片、落后染色體、染色體環(huán)和不均等分裂共6種類型。各類型染色體畸變率均以發(fā)生該類型染色體畸變的細(xì)胞數(shù)占該分裂期細(xì)胞總數(shù)的百分率表示，染色體總畸變率以所有發(fā)生染色體畸變的細(xì)胞總數(shù)占該分裂期細(xì)胞總數(shù)的百分率表示。若一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)了多種畸變類型則重復(fù)計(jì)數(shù)。

1.2.4花粉育性檢測 用碘-碘化鉀溶液（I₂-IK）對成熟期花粉進(jìn)行染色，檢測花粉育性，每處理組至少觀察1000個(gè)花粉細(xì)胞。可育花粉呈橢球形，能被I₂-IK染成黑褐色，不育花粉形狀不規(guī)則，不著色?；ǚ劭捎室钥捎ǚ蹟?shù)占所觀察花粉總數(shù)的百分率表示。

1.2.5農(nóng)藝性狀的測定 分別用米尺和游標(biāo)卡尺測量植株的株高、葉片長和寬，統(tǒng)計(jì)單株葉片數(shù)和節(jié)數(shù)，計(jì)算葉面積。葉面積計(jì)算公式為：葉面積=長×寬×π×1/4。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS13.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1微波輻照對蠶豆種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，CK的發(fā)芽勢明顯低于發(fā)芽率，表明蠶豆的種皮較厚實(shí)，發(fā)芽速度慢，不整齊。微波輻照處理的蠶豆種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均隨著輻照時(shí)間的延長呈先上升后下降趨勢，說明適當(dāng)?shù)奈⒉ㄝ椪漳苘浕N皮，促進(jìn)種子萌發(fā)，但過度輻照，微波穿透種皮到達(dá)種胚，損傷加劇，阻礙種子萌發(fā)。微波輻照5～20s時(shí)，發(fā)芽勢等于發(fā)芽率，進(jìn)一步證實(shí)微波輻照能促進(jìn)種子萌發(fā)；微波輻照15s時(shí)，蠶豆種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均達(dá)最大值（100%）；微波輻照20s時(shí)，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均開始降低；微波輻照30s時(shí)，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均為最小值，且低于CK，表明微波輻照時(shí)間與蠶豆種子萌發(fā)密切相關(guān)。

2.2微波輻照對蠶豆花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響

對微波輻照處理的蠶豆花粉母細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期均能觀察到微核、染色體橋、染色體斷片、落后染色體、染色體環(huán)和不均等分裂等6種染色體畸變類型（圖2和圖3）。對各類型的染色體畸變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1和表2所示。在減數(shù)分裂Ⅰ期，CK的染色體總畸變率較低（0.52%），微波輻照5、10和15s時(shí)，分別出現(xiàn)3-4種染色體畸變類型，染色體總畸變率與CK無顯著差異（P>0.05，下同）；微波輻照20s時(shí)，出現(xiàn)4種染色體畸變類型，染色體總畸變率顯著高于CK（P<0.05，下同）；微波輻照25和30s時(shí)，分別出現(xiàn)6種染色體畸變類型，染色體總畸變率極顯著高于CK（P<0.01，下同）。在減數(shù)分裂Ⅱ期，微波輻照5和10s時(shí)，分別出現(xiàn)3-4種染色體畸變類型，染色體總畸變率與CK差異不顯著；微波輻照15s時(shí)，出現(xiàn)5種染色體畸變類型，染色體總畸變率顯著高于CK；微波輻照20、25和30s時(shí)，分別出現(xiàn)6種染色體畸變類型，染色體總畸變率極顯著高于CK，且在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有2種或2種以上的染色體異?，F(xiàn)象出現(xiàn)（圖2-F和圖3一G）。綜上所述，微波輻照會造成花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期的染色體發(fā)生異常，隨著輻照時(shí)間的延長，染色體畸變類型增多，染色體畸變率升高，兩者呈顯著正相關(guān)（r=0.8432）。

2.3微波輻照對蠶豆花粉育性的影響

各組的蠶豆花粉經(jīng)染色后表現(xiàn)出不同的育性，如圖4所示，可育花粉呈橢球形，被I₂-1K染成黑褐色，不育花粉形狀不規(guī)則，不著色。由表3可知，微波輻照后蠶豆花粉可育率隨著輻照時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢。與CK相比，微波輻照20s時(shí)花粉可育率顯著下降6.17%，微波輻照25和30s時(shí)分別極顯著下降15.68%和23.07%。表明微波輻照會阻礙花粉正常發(fā)育，最終導(dǎo)致敗育。因此，微波輻照時(shí)間與花粉可育率呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.9066）。

2.4微波輻照對蠶豆農(nóng)藝性狀的影響

對微波輻照處理蠶豆植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察測定，結(jié)果如表4所示。微波輻照5、10和15s的蠶豆株高、節(jié)數(shù)、葉面積和單株葉片數(shù)目與CK均無顯著差異。微波輻照20、25和30s的蠶豆株高、葉面積和單株葉片數(shù)與CK存在明顯差異，其中，微波輻照20s的蠶豆株高和單株葉片數(shù)均顯著高于CK；微波輻照25s的蠶豆株高顯著高于CK，葉面積顯著低于CK；微波輻照30s的蠶豆葉面積極顯著低于CK，單株葉片數(shù)顯著低于CK。表明微波輻照20s能促進(jìn)蠶豆植株長高，增加單株葉片數(shù)，隨輻照時(shí)間進(jìn)一步延長，株高、葉面積和單株葉片數(shù)又逐漸降低。

3討論

微波能穿透生物組織，增加分子運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生熱效應(yīng)，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)（Kalns et a1.，2000；Kim and Rhee，2004；滿其航等，2010；王小華等，2016）和DNA損傷（Garai-Vrhovac and Orescanin，2009）。此外，微波輻照可造成生殖系統(tǒng)損傷（牟敬鋒和嚴(yán)宙寧，2013），導(dǎo)致精子畸形（Goud et a1.，1982）。本研究結(jié)果也表明，微波輻照造成花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體畸變，最終導(dǎo)致花粉敗育。前人研究發(fā)現(xiàn)，以不同的物理和化學(xué)誘變劑處理蠶豆，在減數(shù)分裂過程中易出現(xiàn)染色體橋、染色體斷片、染色體環(huán)、微核等染色體畸變類型（Ecochard，1966；Sharma et a1.，2009）。這些畸變在本研究中也觀察到，表明采用不同的誘變方法可獲得相似的誘變效應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，微波輻照5和10 s時(shí)減數(shù)分裂Ⅰ期和Ⅱ期染色體總畸變率與空白對照無顯著差異。羅蔚華等（2012）用微波爐輻照蠶豆，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與本研究相同，結(jié)果在根尖細(xì)胞有絲分裂過程中也觀察到多種染色體畸變類型，但微波輻照處理組的微核率和染色體總畸變率均顯著高于對照。將本研究與羅蔚華等（2012）的研究進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同時(shí)間的微波輻照處理下，減數(shù)分裂染色體總畸變率均低于有絲分裂染色體總畸變率。推測其原因是微波輻照蠶豆后先生根，即輻照損傷先在根尖細(xì)胞中表現(xiàn)，隨著植株生長，在體內(nèi)中畸變細(xì)胞與正常細(xì)胞互相競爭，畸變細(xì)胞逐漸處于落后狀態(tài)，被正常細(xì)胞所代替，最終死亡，植株體細(xì)胞的輻射損傷逐漸減輕并趨于正常，小孢子母細(xì)胞起源于體細(xì)胞，在生殖生長期發(fā)育，因此減數(shù)分裂染色體總畸變率低于有絲分裂染色體總畸變率。

本研究對微波輻照處理的蠶豆種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奈⒉ㄝ椛淠艽龠M(jìn)種子萌發(fā)。這與楊俊紅等（2003）、張淑卿等（2011）的研究結(jié)論相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，微波輻照20s能促進(jìn)蠶豆植株長高，增加單株葉片數(shù)目，對蠶豆育種具有重要意義，但微波輻照對蠶豆植株其他農(nóng)藝性狀的影響有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

微波輻照能誘發(fā)蠶豆花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生染色體畸變，導(dǎo)致花粉敗育。適當(dāng)微波輻射能提高蠶豆種子的萌發(fā)率，改善蠶豆的農(nóng)藝性狀。

（責(zé)任編輯陳燕）