張慧 羅珍珍 由翠榮 孔艷輝 解曉旭 孫印兵

摘要[目的]建立并優(yōu)化‘火焰品種彩色馬蹄蓮組培快繁體系。[方法]以‘火焰品種彩色馬蹄蓮的球莖嫩芽為試驗(yàn)材料，對(duì)其組織培養(yǎng)無(wú)性繁殖體系進(jìn)行研究。[結(jié)果]最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；植株再生最適合培養(yǎng)基為 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。[結(jié)論]該研究建立了‘火焰品種彩色馬蹄蓮的組培快繁體系，為其快速繁殖及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞‘火焰彩色馬蹄蓮；組培快繁；優(yōu)化

中圖分類號(hào)S682.2+64文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）16-0133-03

The Establishment and Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Zantedeschia hybrida ‘Flame

ZHANG Hui1，LUO Zhenzhen1，YOU Cuirong2 et al（1.Yantai Landscape Scientific Institute，Yantai，Shandong 264000；2.College of Life Science，Yantai University，Yantai，Shandong 264005）

Abstract[Objective]To establish and optimze the tissue culture and rapiad progration system of Zantedeschia hybrida ‘Flame.[Method]The bulb shoots of Z.hybrida ‘Flame were used as experimental materials to study the system of tissue culture and rapid propagation.[Result]The optimal medium for induction was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best proliferation medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The most suitable plant regeneration medium was 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The optimum rooting medium was 1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L activated carbon.[Conctustion]The tissue culture and rapid propagation system of Z.hybrida‘Flame was established to provide technology and the theoretical forndation for its rapid propagation and industrialized production.

Key wordsZantedeschia hybrida ‘Flame；Tissue culture and rapid propagation；Optimization

基金項(xiàng)目山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013GNC11037）；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015GNC113）

作者簡(jiǎn)介張慧（1985—），女，山東濟(jì)南人，中級(jí)工程師，碩士，從事園林植物組織培養(yǎng)研究。

收稿日期2017-04-12

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）為天南星科馬蹄蓮屬多年生草本植物，葉形奇特、花色艷麗，不論作為切花還是盆栽都有極好的觀賞效果[1]。近年來(lái)，彩色馬蹄蓮已成為我國(guó)重要的新興花卉品種，具有極大的市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿?。傳統(tǒng)上，彩色馬蹄蓮多采用播種法和塊莖分割繁殖，周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低，在生產(chǎn)繁殖過(guò)程中易受環(huán)境因子的制約[2]。尤其是分生繁殖易誘發(fā)病毒病，導(dǎo)致種系退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，很難保持彩色馬蹄蓮原有的優(yōu)良性狀。組培離體快繁可以有效縮短繁育周期，節(jié)約成本，起到提純復(fù)壯的作用，是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于彩色馬蹄蓮離體快繁無(wú)性體系的建立已有較多研究與報(bào)道。1981 年Cohen等[3]成功地進(jìn)行了馬蹄蓮的離體培養(yǎng)。國(guó)內(nèi)，彩色馬蹄蓮首先于1988年在廣西引種成功[4] ，我國(guó)對(duì)馬蹄蓮組織培養(yǎng)的研究起步較晚，最早于1989年由林榮等[5]報(bào)道了馬蹄蓮離體培養(yǎng)的成功，20世紀(jì)90年代末，李倩中等[6]、吳麗芳等[7]對(duì)彩色馬蹄蓮的組培方法進(jìn)行了研究報(bào)道。2000年后關(guān)于彩色馬蹄蓮離體培養(yǎng)的研究越來(lái)越多，彭峰等[8]對(duì)‘凍糕的組培體系建立進(jìn)行了研究；鄭柱等[9]、張麗等[10]進(jìn)行了黃色馬蹄蓮離體快繁及叢生芽誘導(dǎo)優(yōu)化的研究；束曉春等[11]研究了不同的消毒方法和激素水平對(duì)‘檸檬品種彩色馬蹄蓮離體繁殖的影響；王偉英等[12]對(duì)‘高原品種彩色馬蹄蓮離體快繁各階段的培養(yǎng)條件及激素進(jìn)行了篩選。

‘火焰品種彩色馬蹄蓮，花色艷麗，黃中透紅，猶如火焰，葉型優(yōu)美，帶有透明斑點(diǎn)，市場(chǎng)認(rèn)可度極高，但關(guān)于此品種彩色馬蹄蓮離體快繁的報(bào)道較少，該試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)‘火焰品種彩色馬蹄蓮的叢生芽誘導(dǎo)、增殖、植株再生、生根及試管苗煉苗移栽等進(jìn)行了進(jìn)一步研究和優(yōu)化，以期提出一套適宜該品種彩色馬蹄蓮組培快繁的簡(jiǎn)便快捷的方法，以指導(dǎo)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物為‘火焰品種彩色馬蹄蓮，自新西蘭引進(jìn)，以其球莖嫩芽為外植體，對(duì)其無(wú)性繁殖體系進(jìn)行建立及優(yōu)化。

1.2方法

該試驗(yàn)初培養(yǎng)誘導(dǎo)及不定芽增殖以MS為基本培養(yǎng)基，而植株再生及生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂粉5.8 g/L，蔗糖30 g/L，肌醇、酪蛋白各100 mg/L， pH為5.8，121 ℃/ 20 min高壓滅菌。培養(yǎng)室溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度一般保持在70%～75%，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照周期為每天16 h。

1.2.1不同6-BA濃度對(duì)初代叢生芽誘導(dǎo)的影響。

‘火焰品種球莖嫩芽外植體，先用3 g/L 50%多菌靈可濕性粉劑浸泡12～18 h，再選取球莖上的嫩芽，切成長(zhǎng)度約1 cm的小塊，在中性洗滌劑溶液中浸泡15 min，流水沖洗1 h，無(wú)菌濾紙吸干材料表面水分后，放入無(wú)菌瓶中，用0.1% HgCl2溶液浸泡7 min，再用2% NaClO溶液滅菌10 min，無(wú)菌水沖洗5次，每次5 min。將滅菌后的球莖嫩芽切成0.5 cm左右，接種在NAA濃度為0.2 mg/L，6-BA濃度分別設(shè)置為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種2塊，每個(gè)處理接種15瓶，先暗培養(yǎng)20 d，再進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d統(tǒng)計(jì)并計(jì)算叢生芽誘導(dǎo)率。

1.2.2不同6-BA濃度對(duì)叢生芽繼代增殖的影響。

將各品種彩色馬蹄蓮初代培養(yǎng)得到的叢芽塊分割為約0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種于不同6-BA濃度的MS培養(yǎng)基中，設(shè)置6-BA濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，添加NAA（0.2 mg/L），每個(gè)處理接種10瓶，每瓶6塊，設(shè)3次重復(fù)。光照培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖面積、增殖倍數(shù)以及大于1 cm的植株數(shù)。

1.2.3不同6-BA濃度對(duì)不定芽植株再生的影響。

將叢芽塊分割為約0.5 cm×0.5 cm的小塊，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.2 mg/L），分別設(shè)置6-BA濃度為0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶6塊，設(shè)3次重復(fù)。光照培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽增殖面積、增殖倍數(shù)以及大于1 cm的植株數(shù)。

1.2.4不同活性炭濃度對(duì)再生植株生根的影響。

選取高度均勻、生長(zhǎng)良好、約3 cm的植株，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.2 mg/L），設(shè)置活性炭濃度0（CK）、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶6塊，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各植株的生根數(shù)，調(diào)查株高。

1.3數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行單因素或兩因素方差分析，并采用LSD、Duncans新復(fù)極差法等檢測(cè)各處理組間試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同6-BA濃度對(duì)初代叢生芽誘導(dǎo)的影響

‘火焰品種球莖嫩芽外植體經(jīng)45 d初代培養(yǎng)，在添加不同6-BA濃度的培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)形成叢生芽和愈傷組織。由表1可知，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織和叢生芽都極少且黃化；平均叢生芽誘導(dǎo)率在添加2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中最高（29.6%），該濃度下叢生芽濃綠健壯，生長(zhǎng)狀況最好；而6-BA濃度為3.0 和4.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織相對(duì)較多，叢生芽量少且細(xì)弱。同時(shí)初培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)果顯示，球莖嫩芽作為外植體，可以通過(guò)器官直接發(fā)生途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生不定芽，其最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.2不同6-BA濃度對(duì)叢生芽繼代增殖的影響

由表2可知，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，‘火焰品種不定芽的平均增殖面積和增殖倍數(shù)分別為4.6 cm2和8.2，效果最佳，與其他處理存在顯著差異；在4.0 mg/L 6-BA處理下的增殖效果最差。另外，大于1 cm植株數(shù)在該組試驗(yàn)中都較少，在低濃度1.0 mg/L時(shí)平均分化出1.0株。綜合考察可知，不定芽增殖的最適培養(yǎng)基均為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。

2.3不同6-BA濃度對(duì)不定芽植株再生的影響

光照培養(yǎng)45 d后，不定芽分化率達(dá)100%。由表3可知，6-BA濃度為0.2和0.8 mg/L的處理，不定芽塊生長(zhǎng)較好，增殖面積都超過(guò)4.0 cm2，且6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)為6.4。6-BA濃度為0.2 mg/L時(shí)，大于1 cm植株數(shù)為6.3株，與其他處理具有顯著差異。由此可知，火焰不定芽植株再生的最適培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.4不同活性炭濃度對(duì)再生植株生根和株高的影響

由圖1可知，不同活性炭濃度對(duì)再生植株生根的影響存在顯著差異。未添加活性炭的對(duì)照中，植株根數(shù)較多，但都未超過(guò)1 cm，且植株高度在所有處理中最矮；隨活性炭濃度增高（0～4.0 g/L），植株生根數(shù)先增加后減少?；钚蕴繚舛葹?.0 g/L時(shí)，平均每株生根數(shù)達(dá)2.5條，明顯優(yōu)于其他處理，此時(shí)植株根系長(zhǎng)且發(fā)達(dá)，有許多側(cè)根長(zhǎng)出，平均每株植株高度為6.9 cm。綜合各指標(biāo)結(jié)果表明，活性炭對(duì)‘火焰生根具有顯著促進(jìn)作用，最適濃度為2.0 g/L。

2.5試管苗的煉苗及移栽

將生根試管苗不開(kāi)瓶蓋煉苗3 d，打開(kāi)瓶蓋后煉苗2 d。取出試管苗，在清水中洗滌2次，小心洗去根部的培養(yǎng)基，盡量不要損傷根部。栽到播種土和珍珠巖以3∶1混合的基質(zhì)中，用水澆透，置于苗床上，并搭塑料小拱棚，保濕處理2 d，成活率可達(dá)98%。

3討論

3.1外植體的選擇及初培養(yǎng)叢生芽誘導(dǎo)

該試驗(yàn)是以球莖嫩芽作為外植體，通過(guò)不定芽發(fā)生途徑來(lái)建立離體快繁體系。鄭柱[13]也是以切割直徑為0.4～0.6 cm的嫩芽塊作為外植體，認(rèn)為添加NAA 0.1 mg/L、6-BA 2.0 mg/L至MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果最好；趙潤(rùn)洲等[14]也是通過(guò)不定芽途徑建立彩色馬蹄蓮離體快繁體系，得出最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。也有很多學(xué)者以葉片作為外植體，采用愈傷組織間接發(fā)生途徑，如龔雪琴等[15]選用葉片作為外植體，認(rèn)為在MS 培養(yǎng)基中添加6-BA 和2，4-D 對(duì)愈傷誘導(dǎo)率有顯著影響，6-BA和2，4-D 影響胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，不同激素的配比也是關(guān)鍵因素；劉金朗[16]對(duì)2種彩色馬蹄蓮品種的幼嫩葉片進(jìn)行了初代誘導(dǎo)研究，認(rèn)為在MS+ KT 5.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，30～40 d即可產(chǎn)生愈傷組織。

2種方式都可以建立植物的離體快繁體系，以葉片作為外植體是通過(guò)脫分化形成愈傷組織，再分化出不定芽，然后進(jìn)行繼代增殖，生根培養(yǎng)，最終形成再生植株。相對(duì)而言，這一過(guò)程比較漫長(zhǎng)且容易引起變異，使再生植株失去原有的優(yōu)良性狀。而通過(guò)誘導(dǎo)不定芽建立其離體快繁體系，能夠縮短時(shí)間，節(jié)省成本，且有利于優(yōu)良性狀的保持[2]。通過(guò)何種方式建立快繁體系也與植物品種及外植體的選擇有較大關(guān)系。

3.2品種增殖及植株再生的激素及濃度

彩色馬蹄蓮組培過(guò)程中，激素濃度和種類是影響其快繁增殖及分化的主要因素 [17-19]。該研究顯示，6-BA濃度是影響叢生芽增殖的關(guān)鍵因素，試驗(yàn)通過(guò)6-BA與NAA配合使用來(lái)促進(jìn)不定芽的增殖，結(jié)果表明1.0～4.0 mg/L 6-BA均可實(shí)現(xiàn)增殖，但明顯表現(xiàn)為低濃度下促進(jìn)不定芽再生植株的生長(zhǎng)，而高濃度有利于不定芽的大量增殖。這與鄭柱[13]、王進(jìn)忠等[20]的觀點(diǎn)一致。前者認(rèn)為在添加1.5～2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時(shí)，能顯著促進(jìn)黃花馬蹄蓮叢生芽的大量增殖，而后者認(rèn)為高濃度6-BA 有利于愈傷組織和芽的分化，低濃度則對(duì)芽的生長(zhǎng)有利。另外選擇生長(zhǎng)素0.2 mg/L NAA與細(xì)胞分裂素6-BA相互配合來(lái)促進(jìn)植株再生，這與王偉英等[12]、張麗等[10]的研究觀點(diǎn)是一致的。也有研究者采用6-BA與其他的激素配合來(lái)促進(jìn)不定芽增殖及分化。何俊蓉等[21]認(rèn)為，叢芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L，再將其轉(zhuǎn)接到低濃度的NAA 上以促進(jìn)不定芽分化成苗；龔雪琴等[15]認(rèn)為，繼代和愈傷組織繼續(xù)發(fā)生的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L。研究結(jié)果不盡相同，可能與研究品種不同及離體快繁體系各環(huán)節(jié)預(yù)設(shè)條件不同都有一定的關(guān)系。

45卷16期張 慧等‘火焰品種彩色馬蹄蓮組培快繁體系的建立及優(yōu)化

3.3再生植株生根該試驗(yàn)添加2.0 g/L活性炭促進(jìn)再生植株生根，這與趙潤(rùn)洲等[14]、李開(kāi)云等[22]的研究觀點(diǎn)是一致的，只是活性炭的添加量存在差異。趙潤(rùn)洲等[14]認(rèn)為，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 mg/L；李開(kāi)云等[22]認(rèn)為，MS+NAA 0.5 mg/L+0.2%活性炭效果最好。該試驗(yàn)選取NAA作為促進(jìn)生根的外源激素，也有很多研究采用IBA作為外源激素，如張軍云等[23]認(rèn)為添加IBA 0.3 mg/L對(duì)生根的誘導(dǎo)效果最佳；孫新政等[24]用6-BA配合0.2 mg/L IBA促進(jìn)紅色馬蹄蓮生根；邵果園等[17]用0.2 mg/L IBA促進(jìn)黃色馬蹄蓮生根，促進(jìn)生根所選用激素不同可能與品種不同有較大的關(guān)系。應(yīng)用何種激素更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠也是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要考慮的問(wèn)題。

4結(jié)論

該試驗(yàn)建立并優(yōu)化了‘火焰品種彩色馬蹄蓮的離體快繁無(wú)性繁殖體系，結(jié)果表明，以球莖嫩芽作為外植體，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)29.6%，此時(shí)叢生芽量多，生長(zhǎng)健壯；最佳增殖配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍數(shù)最大為8.2；植株再生最適合培養(yǎng)基為 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。

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