劉寶彪 張昆明 黃永春 黃承都 楊鋒 任仙娥

摘 要：為探討渦流空化強化載藥殼聚糖微球的制備效果，研究傳統(tǒng)離子凝膠法制備殼聚糖載藥微球的最佳工藝，了解空化強化制備的載藥微球的體外釋放規(guī)律，在單因素試驗的基礎上，通過四因素三水平的響應面分析法研究了殼聚糖質量濃度、甲基異噻唑啉酮（MIT）濃度、三聚磷酸鈉（TPP）質量濃度、攪拌轉速對殼聚糖抗菌微球包封率的影響.結果表明，響應面法優(yōu)化的最佳工藝為：殼聚糖質量濃度3.5 g/L，MIT濃度0.50 mmol/L，TPP質量濃度2.5 g/L，攪拌轉速1 500 r/min，攪拌時間20 min，載藥微球包封率為37.64%；在此基礎上，渦流空化20 min，渦流空化出口壓力0.3 MPa時，微球的包封率達50.33%，比傳統(tǒng)法優(yōu)化后制備微球的包封率高了12.69%；渦流空化制備的載藥微球在體外釋放60 h后，MIT的累積釋放量達78.79%.與傳統(tǒng)離子凝膠制備方法相比，渦流空化能有效提高殼聚糖微球載藥的包封率.

關鍵詞：渦流空化；殼聚糖微球；包封率

中圖分類號：O636.1 文獻標志碼：A

0 引言

水力空化是指當液體內部分壓力低于飽和蒸汽壓時，液體內部或液固界面上蒸汽或氣體空穴（空化泡）的形成、發(fā)展和潰滅過程[1-2].空化泡在隨液體流動時潰滅的瞬間會在其周圍狹小的空間范圍內產(chǎn)生高溫（1 000 K ～5 000 K）、瞬時高壓（1 MPa ～50 MPa）等極端環(huán)境效應，并伴有強烈的沖擊波、微射流和劇烈湍動等機械效應，同時水溶液中可產(chǎn)生羥自由基等活化效應[3-4]，這些效應可用于強化物理過程和化學過程.如，已有報道利用水力空化強化破乳加工過程[5]、油-醇的非均相混合制生物柴油[6]、高酸油脂脫酸[7]、酯交換反應[8]、高級脂肪酸-醇不互溶體系的酯化反應[9]、有機物降解[10]等有明顯的效果.渦流空化作為水力空化方式之一，迄今為止鮮見其用于強化制備殼聚糖微球的研究報道.

殼聚糖作為天然生物資源具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，且安全無毒，并具有抗菌、保鮮和防腐的作用，其作為功能活性物質和藥劑的載體，可起到控制藥物釋放、延長藥效、降低毒副作用等功效[11-12].殼聚糖微球載體的制備是殼聚糖資源高值化加工與利用的研究熱點之一，并在食品、生物和醫(yī)藥領域作為活性載體用于負載一些有價值的多肽、蛋白質、氨基酸、維生素和抗癌藥物等[13-14].目前，殼聚糖微球的主要制備方法包括乳化交聯(lián)法、凝聚-沉淀法、噴霧干燥法和離子凝膠法等，其中離子凝膠法在實際制備中利用殼聚糖經(jīng)質子化后帶正電的氨基與帶負電的物理交聯(lián)劑聚陰離子，二者通過靜電作用發(fā)生物理交聯(lián)，制備的殼聚糖微球存在機械強度低、易粘連、藥物負載率低等問題[11].同時針對離子凝膠法制備殼聚糖微球工藝的研究較少，而且國內外學者大多采用傳統(tǒng)的機械攪拌方式，采用其他的輔助技術較少.甲基異噻唑啉酮（MIT）在殺菌和防腐方面具有高效的優(yōu)點，并且耐熱、在水中易溶解，可以有效抑制細菌、真菌、霉菌及霉菌的生長[15].

為能夠同時發(fā)揮殼聚糖與抗菌藥物的抑菌性能，本試驗以甲基異噻唑啉酮作為負載抗菌藥劑，采用離子凝膠法制備殼聚糖微球.在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化傳統(tǒng)離子凝膠法制備殼聚糖抗菌微球工藝；在傳統(tǒng)優(yōu)化工藝的基礎上，結合渦流空化用于制備殼聚糖微球，并將其與傳統(tǒng)制備工藝進行比較，以期為殼聚糖微球的強化制備提供一種新方法.

1 試驗部分

1.1 實驗原料與方法

1.1.1 實驗原料

殼聚糖（脫乙酰度為87 %），購自上海市卡博工貿有限公司；冰乙酸，三聚磷酸鈉（TPP），均為分析純（AR），購于成都市科龍化工試劑廠；甲基異噻唑啉酮（MIT），質量分數(shù)10%，購自湖北巨勝科技有限責任公司.

1.1.2 儀器與設備

1/2DW-750型高壓渦流泵（浙江奧龍科技開發(fā)有限公司），Cary 60紫外分光光度計（美國Agilent Technologies公司），ZNCL-TS型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 傳統(tǒng)離子凝膠法制備殼聚糖微球

稱取一定質量的殼聚糖溶解于100 mL 1%的乙酸溶液中，控制溶液pH為3.0；然后將不同濃度的50 mL MIT溶液與不同質量濃度的40 mL TPP溶液充分混合均勻，在一定轉速的磁力攪拌下將其加入到溶解的殼聚糖溶液中，并連續(xù)攪拌20 min，制得載MIT藥物的殼聚糖微球.

1.2.2 渦流空化強化實驗裝置與流程

渦流空化裝置如圖1所示[16].將配置好的殼聚糖溶液倒入渦流空化實驗裝置的料液貯槽（1）中，開啟渦流泵（4），通過調節(jié)閥門（2）控制渦流泵的進口壓力和出口壓力，并通過壓力計（3）分別監(jiān)測渦流泵的進口壓力、出口壓力，同時開啟冷凝水通過恒溫水槽，控制反應溫度保持在25 ℃，在達到所需的渦流出口壓力后，將MIT溶液和TPP溶液二者的混合溶液加入到料液槽（1）中，每隔一段時間在料液槽中可收集經(jīng)渦流空化強化制備得到的載MIT藥物的殼聚糖微球.

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 殼聚糖質量濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持攪拌轉速1 300 r/min，MIT 濃度0.50 mmol/L，TPP質量濃度2.0 g/L 不變，以殼聚糖質量濃度分別為1.0 g/L，2.0 g/L，3.0 g/L，4.0 g/L，5.0 g/L 進行實驗，探討不同殼聚糖質量濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.3.2 MIT 濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持攪拌轉速1 300 r/min，殼聚糖質量濃度3.0 g/L，TPP 質量濃度2.0 g/L 不變，以MIT 濃度分別為0.10 mmol/L，0.125 mmol/L，0.25 mmol/L，0.50 mmol/L，1.0 mmol/L 進行實驗，探討不同MIT 濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.3.3 TPP 質量濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持攪拌轉速1 300 r/min，殼聚糖質量濃度3.0 g/L，MIT 濃度0.50 mmol/L 不變，以TPP質量濃度分別為1.5 g/L，2.0 g/L，2.5 g/L，3.0 g/L，3.5 g/L 進行實驗，探討不同TPP 質量濃度對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.3.4 攪拌轉速對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持殼聚糖質量濃度3.0 g/L，MIT 濃度0.50 mmol/L，TPP 質量濃度2.0 g/L不變，以攪拌轉速分別為700 r/min，1 000 r/min，1 300 r/min，1 600 r/min，1 900 r/min 進行實驗，探討不同攪拌轉速對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.3.5 渦流空化時間對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持渦流出口壓力0.3 MPa， 殼聚糖質量濃度3.0 g/L， MIT 濃度0.50 mmol/L， TPP質量濃度 2.0 g/L 不變，以渦流空化時間分別為5 min，10 min，15 min，20 min，25 min 進行強化實驗，探討不同空化時間對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.3.6 渦流出口壓力對載藥殼聚糖微球包封率的影響

實驗保持渦流空化時間25 min， 殼聚糖質量濃度3.0 g/L， MIT 濃度0.50 mmol/L， TPP質量濃度 2.0 g/L 不變，以渦流出口壓力分別為0.1 MPa，0.2 MPa，0.3 MPa，0.4 MPa，0.5 MPa 進行強化實驗，探討不同渦流出口壓力對載藥殼聚糖微球包封率的影響.

1.2.4 響應面優(yōu)化設計

根據(jù)單因素試驗結果可知，殼聚糖質量濃度（A），MIT濃度（B），TPP 質量濃度（C），攪拌轉速（D）對傳統(tǒng)方法制備殼聚糖微球的包封率影響都比較顯著，故選擇這4個因素作為自變量，以殼聚糖微球包封率為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理進行響應面設計，試驗因素與水平編碼如表1 所示.

1.2.5 載藥殼聚糖微球的包封率測定

用離心機將制備的載藥殼聚糖微球乳液進行固液分離，離心機的轉速保持12 000 r/min，20 min后取出上清液，用紫外分光光度儀對上清液中的MIT濃度進行測定（λ=273 nm），算出微球的包封率，計算公式如下[17]：

微球的包封率=（（m1-m2）/ m1）×100%

其中，m1為總的MIT量，m2為游離的MIT量.

1.2.6 載藥殼聚糖微球的體外釋放

在透析袋中放入一定質量的載藥殼聚糖微球，然后把放入緩沖溶液中的透析袋在恒溫振蕩器中振蕩，保持37 ℃恒溫，每過一段時間取定量的緩沖溶液對MIT的濃度進行檢測，算出微球的包封率，計算出甲基異噻唑啉酮的累積釋放率，同時添加等量的新的緩沖溶液，以保持原溶液的總體積不發(fā)生變化.計算公式為[17]：

MIT累積釋放率Q（%）=V0×Ct+V ×■C/E×W×V′/V總

式中：V0——緩沖溶液的總體積，Ct——每個時間段測定的MIT濃度，V——每次取樣的體積，E——微球的包封率，W——MIT總的加入量，V'——添加的微球乳液體積，V總——溶液的總體積.

2 結果與討論

2.1 殼聚糖質量濃度對載藥微球包封率的影響

圖2是殼聚糖質量濃度對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖2可以看出，隨著殼聚糖質量濃度的增大，殼聚糖微球對MIT的包封率先增加后減少.這是因為隨著殼聚糖質量濃度的增加，形成微球的數(shù)量也相對增加，微球的載藥量也隨之增加.但是，微球的載藥量并不會隨著殼聚糖的增加而一直增加，因為隨著殼聚糖的增加，溶液的黏度會增大，這不利于微球的形成.

2.2 藥物MIT濃度對載藥微球包封率的影響

圖3是MIT濃度對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖3可知，隨著MIT濃度增加，包封率先是快速增加，最后變化不大.這是由于MIT濃度較小時，在溶液中殼聚糖成球時接觸MIT的幾率小，所以當濃度增加時，可以增加微球成球時接觸MIT的幾率.濃度從0.50 mmol/L增加到1.0 mmol/L時，微球的包封率雖然降低了，但微球載藥量是增加的，只是載藥量增加的程度沒有藥量增加的程度大.

2.3 TPP質量濃度對載藥微球包封率的影響

圖4是TPP質量濃度對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖4可知，隨著TPP質量濃度的增加，殼聚糖微球的包封率也在增加，這是由于殼聚糖過量，微球的數(shù)量隨著TPP質量濃度的變大也相對增加，從而使得包裹的藥物量增加.但是，當殼聚糖消耗到一定程度時，包封率就不會隨著TPP質量濃度的增加而增加.

2.4 攪拌轉速對載藥微球包封率的影響

圖5是攪拌轉速對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖5可知，隨著轉速的增加，殼聚糖微球的包封率先是快速增加，最后變化不大.這是由于當轉速較小時，MIT與TPP組成的混合溶液加入到殼聚糖溶液中，不能快速的混合均勻，殼聚糖在大量的TPP作用下，快速聚集，形成球狀的殼聚糖，只能使局部的MIT被吸收.隨著轉速的增加，MIT與TPP組成的混合溶液加入到殼聚糖溶液中，被快速混合均勻，形成殼聚糖微球.

2.5 渦流空化時間對載藥微球包封率的影響

圖6是空化時間對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖6可知，隨著空化時間的增加，殼聚糖微球的包封率先是快速增加，最后變化不大.這是由于水力空化具有強化混合的作用，使溶液快速混合，充分反應.當空化時間達到20 min時，殼聚糖微球的包封率隨空化時間的延長呈現(xiàn)緩慢增大趨勢，這一結果說明殼聚糖微球對MIT藥物的包埋基本達到飽和狀態(tài)，此時殼聚糖微球的包封率基本保持在48.32%.

2.6 渦流出口壓力對載藥微球包封率的影響

圖7是渦流出口壓力對載藥微球包封率影響的趨勢圖.由圖7可知，隨著壓力的增大，殼聚糖微球的包封率先增大后減小，殼聚糖微球的包封率最大時達到46.31%.這是由于壓力較小時，MIT與TPP組成的混合溶液加入到殼聚糖溶液中，不能快速的混合均勻，使一些殼聚糖不能形成微球，成絮狀物，不能很好地吸附藥物；當壓力過大時，會使形成的殼聚糖微球破裂，把所含的藥物重新分散到溶液中.

2.7 響應曲面設計及實驗結果

使用Design-Expert 8.0軟件，按Box-Behnken原理設計實驗，以載藥微球的包封率為指標，設計4因素3水平（共29個實驗點，5個中心點）的響應面試驗，試驗設計及結果見表2.

利用Design-Expert軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到殼聚糖微球包封率對以上4個因素的二次多項回歸模型為：包封率=36.90+6.04A+3.28B+0.017C+0.075D+3.47AB-0.20AC-0.25AD-0.17BC-0.34BD+0.050CD-7.00A2-11.57B2-0.95C2-0.84D2.

對上述模型進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表3.

由表3可知，回歸模型的P <0.000 1，表明該回歸模型的回歸效果極為顯著；失擬項P>0.05，即模型失擬項不顯著，說明模型是合適的.模型的校正決定系數(shù)R■■為0.911 4，說明所得模型方程與選擇的各獨立變量之間有較好的相關性；R2=0.955 7 ，說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，可以利用該模型分析和預測實驗結果.

響應面模型的顯著性分析結果表明，A，B，A2，B2對制備載藥殼聚糖微球包封率的影響極為顯著（P<0.01），AB對載藥殼聚糖微球包封率的影響顯著（P<0.05），由此可以說明各影響因素對載藥殼聚糖微球包封率的影響不是簡單的線性關系.另外，根據(jù)P值的大小，可得到各因素對殼聚糖微球包封率影響的強弱順序為：A>B>C>D.

對二元多次回歸模型進行分析并求解，通過軟件模擬分析得到渦流空化強化制備載藥殼聚糖微球的最佳工藝條件為：殼聚糖質量濃度為3.44 g/L，MIT濃度為0.71 mmol/L， TPP質量濃度為2.66 g/L， 轉速為 1 417 r/min， 模型預測載藥殼聚糖微球的包封率達到最大約為38.008%.考慮實際操作情況， 確定載藥殼聚糖微球制備的最佳工藝參數(shù)為： 殼聚糖質量濃度為3.5 g/L， MIT濃度為0.50 mmol/L， TPP質量濃度為2.5 g/L，轉速為1 500 r/min.

為了檢驗制備模型方程的合適性和有效性，按照載藥殼聚糖微球制備的最佳工藝參數(shù)進行驗證試驗.重復3次，殼聚糖微球的包封率為38.01%，37.79%，37.12%，其平均值（37.64%）與模型的預測值（38.01%）的差值僅占預測值的0.97%，與預測值接近，說明該模型可以較好地反映出傳統(tǒng)離子凝膠法制備載藥殼聚糖微球的包封率.

2.8 渦流空化的強化效果

在單因素試驗和響應面試驗設計優(yōu)化傳統(tǒng)離子凝膠法制備工藝的基礎上，渦流空化強化載藥殼聚糖微球制備采用如下工藝參數(shù)：殼聚糖質量濃度3.5 g/L，MIT濃度0.50 mmol/L，TPP質量濃度為2.5 g/L，渦流空化出口壓力0.3 MPa，控制空化時間分別為20 min，25 min，30 min和35 min，將所制得微球的包封率與傳統(tǒng)離子凝膠法優(yōu)化制備微球的包封率進行比較.

由表4可知，傳統(tǒng)方法和渦流空化法制備在相同的20 min時，傳統(tǒng)離子凝膠法優(yōu)化制備微球的包封率為37.64 %，渦流空化法強化制備殼聚糖微球的包封率為50.33 %.這一結果說明渦流空化法比傳統(tǒng)方法優(yōu)化后制備微球的包封率提高了12.69 %.由此可知，渦流空化是強化殼聚糖微球制備的一種有效方法.

2.9 渦流空化強化制備載藥殼聚糖微球的體外釋放規(guī)律

由圖8可知，渦流空化強化制備殼聚糖包裹MIT的微球在水介質中MIT的累計釋放率隨時間延長呈增大趨勢，即載藥殼聚糖微球在水介質中整體上呈現(xiàn)緩慢釋放的現(xiàn)象.載藥殼聚糖微球在10 h內MIT的累計釋放率迅速增大，這說明載藥微球的MIT釋放速度較快；隨著釋放時間的延長，MIT釋放的速度越趨緩慢，在60 h左右MIT累積釋放率達78.79%，曲線趨于平緩，這說明MIT藥物基本釋放完全.以上結果說明，渦流空化強化制備的載藥殼聚糖微球表現(xiàn)出良好的緩釋特性.

3 結論

1）利用Design-Expert試驗設計軟件，通過響應面法建立了傳統(tǒng)離子凝膠法制備殼聚糖微球的數(shù)學模型，優(yōu)化了制備工藝條件，得到了載藥殼聚糖微球制備的最佳工藝參數(shù)為：殼聚糖質量濃度3.5 g/L，MIT濃度0.50 mmol/L，TPP質量濃度2.5 g/L，攪拌轉速1 500 r/min，攪拌時間20 min，載藥殼聚糖微球的包封率可達37.64%；

2）渦流空化強化載藥殼聚糖微球制備工藝參數(shù)：殼聚糖質量濃度3.5 g/L，MIT濃度0.50 mmol/L，TPP質量濃度為2.5 g/L，渦流空化20 min，空化出口壓力0.3 MPa時，微球的包封率達50.33%，比傳統(tǒng)法優(yōu)化后制備微球的包封率提高了12.69%.說明渦流空化是強化殼聚糖微球制備的一種有效方法.

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Study on enhancement preparation of chitosan drug-loaded microspheres by swirling cavitation

LIU Bao-biao1，2，3， ZHANG Kun-ming1，2，3， HUANG Yong-chun*1，2，3， HUANG Cheng-du1，2，3，

YANG Feng1，2，3， REN Xian'e1，2，3

（1.School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China； 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China； 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutions （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： In order to study the enhancement preparation of drug-loaded chitosan microspheres by swirling cavitation， the optimal conditions of preparation of drug-loaded chitosan microspheres by conventional ionic-crosslinking method， and the release of drug-loaded chitosan microspheres by swirling cavitation in vitro were investigated. Based on the single factor experiment and four-factor and three-level response surface methodology， the effects of chitosan concentration， methylisothiazolinone （MIT） concentration， tripolyphosphate （TPP） concentration， stirring speed on entrapment efficiency of chitosan microspheres were studied. The results showed that the optimum technological conditions were as follows： chitosan concentration 3.5 g/L， MIT concentration 0.50 mmol/L， TPP concentration 2.5 g/L， stirring speed 1 500 r/min， stirring time 20 min， and the entrapment efficiency could be up to 37.64%. On the basis of the optimal technological conditions， the swirling cavitation was introduced to enhance preparation of drug-loaded chitosan microspheres， and the cavitation time was kept for 20 min， the outlet pressure of swirling cavitation was kept at 0.3 MPa， then the entrapment efficiency could be up to 50.33%， which increased by 12.69% than that obtained by the optimized conventional ionic-crosslinking method. The accumulation of drug releasein vitro for drug-loaded chitosan microspheres prepared by swirling cavitation could be up to 78.79% after 60 h. Compared with the conventional ionic-crosslinking method， it is concluded that the enhancement preparation of drug-loaded chitosan microspheres by swirling cavitation is an effective method.

Key words： swirling cavitation； chitosan microsphere； encapsulation efficiency

（學科編輯：黎 婭）