桓瓊莎 伍時(shí)華 趙東玲 黃翠姬 易弋

摘 要：研究了釀酒酵母GJ2008和釀酒酵母GGSF16不同接種比例（V/V）在酒精發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖和果糖利用的差異性，為蔗汁木薯粉酒精發(fā)酵提供研究基礎(chǔ).以等質(zhì)量濃度的葡萄糖與果糖（總糖220 g/L）混合進(jìn)行酒精發(fā)酵，調(diào)節(jié)釀酒酵母GJ2008與GGSF16不同接種比例（10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10，以初始酵母數(shù)為4.0×107 CFU/mL）進(jìn)行酒精發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中總糖﹑葡萄糖﹑果糖﹑乙醇的變化，采用曲線(xiàn)下面積法和糖代謝一半與代謝完全所需時(shí)間法對(duì)兩種糖利用差異性進(jìn)行分析.結(jié)果表明：果糖的利用速率小于葡萄糖的利用速率，隨著酵母菌株GGSF16接種量的增加，葡萄糖利用速率加快，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，混合酵母菌株對(duì)果糖代謝的影響程度高于其對(duì)葡萄糖的影響程度；兩種酵母菌株的接種比例對(duì)乙醇產(chǎn)量無(wú)明顯影響；相比較之下，0∶10組總糖發(fā)酵效率和耗糖發(fā)酵效率均較高；因此，釀酒酵母GJ2008和GGSF16最佳接種比例為0∶10（V/V）.

關(guān)鍵詞：混合菌種；果糖；葡萄糖；曲線(xiàn)下面積；酒精發(fā)酵

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引言

將甘蔗和木薯作為燃料乙醇的候選原料已經(jīng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1-2]，目前國(guó)內(nèi)外已有將兩種原料混合進(jìn)行酒精發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道[3-5].甘蔗汁與木薯粉混合發(fā)酵過(guò)程中，甘蔗汁中蔗糖被水解成葡萄糖和果糖，木薯淀粉在糖化酶的作用下水解生成大量的葡萄糖.葡萄糖與果糖在酒精發(fā)酵過(guò)程中共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系[6-7]，而果糖對(duì)膜運(yùn)輸和酶催化體系的親和度小于葡萄糖，所以?xún)煞N糖在發(fā)酵過(guò)程中的利用必存在差異性.目前，酒精發(fā)酵過(guò)程中，影響葡萄糖和果糖利用差異性的因素主要有可同化氮[8]﹑糖濃度[9]﹑溫度[10]﹑葡萄糖與果糖比例[11]﹑菌種性能[12]等，混合酵母對(duì)糯米酒風(fēng)味改善研究也有所報(bào)道[13].而關(guān)于混合酵母菌株對(duì)葡萄糖與果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精過(guò)程中兩糖利用差異性影響的研究尚不清楚，因此有必要對(duì)此問(wèn)題開(kāi)展研究.

本研究以釀酒酵母GJ2008，GGSF16為出發(fā)菌株，等質(zhì)量濃度的葡萄糖和果糖混合作為發(fā)酵培養(yǎng)基，采用混合菌株進(jìn)行酒精發(fā)酵，研究混合菌株酒精發(fā)酵過(guò)程對(duì)葡萄糖與果糖利用差異性的影響，以期為甘蔗汁與木薯粉混合酒精發(fā)酵提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008和GGSF16：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面活化培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH.

一級(jí)種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.

二級(jí)種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖±110 g/L，果糖±110 g/L，自然pH.

以上培養(yǎng)基均于115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYD-2402疊式恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SBA-40生物傳感儀：山東科學(xué)院生物研究所；SGD-IV全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀：山東科學(xué)院生物研究所；SW-CJ-TB標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)：蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mikro220R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種有限公司.

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)方法 將實(shí)驗(yàn)室保藏菌種GJ2008，GGSF16經(jīng)30 ℃斜面活化1 d～2 d后分別接種至一級(jí)種子培養(yǎng)基中，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)12 h，以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量分別轉(zhuǎn)接至二級(jí)種子培養(yǎng)基中，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)10 h后，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，棄上清液得濕酵母泥，加入無(wú)菌水振蕩混合制得10倍濃縮種子懸液.

1.3.2 酒精發(fā)酵方法 以原菌液體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量計(jì)，將2 mL10倍濃縮種子液接種至裝液量為200 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行果糖和葡萄糖混合酒精發(fā)酵，其中釀酒酵母GJ2008與GGSF16接種比（V/V）為10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10.初始酵母數(shù)約4.0×107 CFU/mL，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，透氣膜和牛皮紙包扎封口進(jìn)行非嚴(yán)格厭氧發(fā)酵，每組3個(gè)平行試驗(yàn).發(fā)酵開(kāi)始0 h，3 h，6 h以后每隔6 h取樣并測(cè)CO2失重，CO2失重小于0.2 g時(shí)發(fā)酵結(jié)束.

1.3.3 成分分析方法 樣品處理：取2 mL發(fā)酵液，12 000 r/min冷凍離心3 min，取上清液于-60 ℃儲(chǔ)存，備用.

葡萄糖和乙醇含量采用生物傳感分析儀測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.075%，葡萄糖質(zhì)量濃度為1 g/L，采用還原糖測(cè)定儀測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖質(zhì)量濃度.果糖質(zhì)量濃度等于還原糖質(zhì)量濃度減去葡萄糖質(zhì)量濃度.

1.3.4 糖代謝曲線(xiàn)分析 運(yùn)用GraphPad Prism 5.0軟件繪制果糖和葡萄糖的代謝曲線(xiàn)，并分別獲得果糖與葡萄糖代謝曲線(xiàn)下面積（area under the fermentation curve，AUC）[14]，記作果糖AUC和葡萄糖AUC.

運(yùn)用Origin 9.0軟件對(duì)糖代謝進(jìn)行非線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合，Boltmann S型函數(shù)是葡萄糖和果糖代謝擬合較好的方程，選擇相關(guān)系數(shù)R2最大的函數(shù)作為其擬合方程，通過(guò)擬合方程分別計(jì)算出兩種糖消耗一半和消耗完全所用的時(shí)間，記作tF50，tG50和tFend，tGend[7].

1.3.5 計(jì)算方法

總發(fā)酵效率=×100%

乙醇產(chǎn)率g/（L·h）=

2 結(jié)果與討論

2.1 糖代謝時(shí)間法分析葡萄糖與果糖利用差異

圖1為混合酵母菌株不同接種比例條件下葡萄糖和果糖的代謝擬合曲線(xiàn)，糖代謝擬合方程見(jiàn)表1.由圖1可知，發(fā)酵6 h ～18 h，每組比值中果糖的含量總是高于葡萄糖；不同小組間，同一發(fā)酵時(shí)間，接種比值越大，果糖含量越小.等量的葡萄糖與果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，隨著兩菌株接種比值的減小，兩糖消耗曲線(xiàn)逐漸拉開(kāi).采用Origin 9.0軟件對(duì)兩種糖代謝過(guò)程進(jìn)行非線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合，Boltmann S型函數(shù)是擬合較好的方程，見(jiàn)表1.由表1可知，所得到的擬合方程的R2在0.991 8～0.997 7之間，擬合程度較好，能夠簡(jiǎn)單、直觀(guān)地描述發(fā)酵過(guò)程中糖代謝的變化，葡萄糖和果糖代謝過(guò)程的擬合曲線(xiàn)類(lèi)型受兩菌株接種比例影響不大.

糖消耗一半和消耗完全的時(shí)間可以表示菌株對(duì)糖利用的快慢，時(shí)間越短，表示菌株對(duì)糖利用越快[6].根據(jù)表1擬合方程計(jì)算可獲得葡萄糖和果糖的t50，tend值，結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知，在酵母菌株不同接種比例下，tF50和tFend一直大于tG50和tGend，表明酒精酵母對(duì)葡萄糖的嗜好性更強(qiáng).隨著釀酒酵母GGSF16接種量的增加，tG50隨之減小，說(shuō)明葡萄糖利用快慢與GGSF16接種量有關(guān).

表3中， tnF50/t0F50，tnG50/t0G50和tnGend/t0Gend的大小表明葡萄糖與果糖的利用情況受兩酵母菌種接種比例的影響程度.由表3可知，不同接種比例下tnG50/t0G50一直小于tnF50/t0F50，說(shuō)明果糖的代謝受兩種菌株接種比例的影響更為明顯.

2.2 曲線(xiàn)下面積法分析葡萄糖與果糖利用差異

發(fā)酵程度的好壞可以通過(guò)糖利用情況來(lái)評(píng)估，本研究采用曲線(xiàn)下面積法對(duì)糖利用情況進(jìn)行直觀(guān)判斷，AUC值越小，表示菌株對(duì)糖利用越快[14].由表4可知，兩酵母菌株接種比同水平下，果糖AUC值總是大于葡萄糖AUC值；果糖AUC值隨著接種比例的減小而增大，葡萄糖AUC值隨著接種比例的減小而減小，表明兩種菌株對(duì)葡萄糖的偏好均明顯優(yōu)于果糖，證明酵母菌對(duì)葡萄糖具有嗜好性，并隨著酵母菌株GGSF16接種量的增大，葡萄糖代謝速度加快.

表5中，在兩酵母菌株不同接種量比例下，糖利用受接種比例影響的程度可以通過(guò)糖代謝曲線(xiàn)下面積比值果糖AUC/果糖AUC和葡萄糖AUC/葡萄糖AUC進(jìn)行比較，比值越大，表明該糖類(lèi)受菌株接種比例影響程度越大[15].由表5可知，果糖AUC/果糖AUC總是大于葡萄糖AUC/葡萄糖AUC，說(shuō)明酵母菌株接種比例對(duì)果糖的代謝影響更明顯.

2.3 dGF /dG法分析葡萄糖與果糖利用差異

dGF/dG=[dG- dF]/ dG，即[葡萄糖消耗速率（dG）-果糖消耗速率（dF）]/葡萄糖消耗速率（dG）， dGF/dG值是衡量葡萄糖與果糖利用差異性指標(biāo)之一[8，15].酵母菌株不同接種比例下葡萄糖與果糖混合發(fā)酵dGF/dG值見(jiàn)圖2.由圖2可知，發(fā)酵過(guò)程中dGF/dG值均呈減小趨勢(shì)，6 h～12 h尤其明顯，表明此階段葡萄糖的利用速率大于果糖的利用速率；之后dGF/dG值不斷減小直至發(fā)酵結(jié)束，說(shuō)明發(fā)酵后期葡萄糖與果糖的利用差異性在不斷縮小，這可能與發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的可同化氮量有關(guān)[16].

2.4 混合酵母菌株不同接種比例條件下酒精發(fā)酵參數(shù)的比較分析

酵母菌株不同接種比例條件下，葡萄糖和果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精主要參數(shù)見(jiàn)表6.從殘總糖質(zhì)量濃度，發(fā)酵周期、酒精度、乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率及耗糖發(fā)酵效率來(lái)看，各比例小組相互之間差別不大；相比較之下，0∶10組不論是酒精度，還是乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率及耗糖發(fā)酵效率均較高，所以葡萄糖和果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，0∶10（即僅含酒精酵母GGSF16）時(shí)發(fā)酵效果最好.

3 結(jié)論

本文研究了釀酒酵母GJ2008和GGSF16接種比例對(duì)葡萄糖果糖利用差異性的影響，結(jié)果表明：發(fā)酵前中期釀酒酵母對(duì)果糖的利用速率低于其對(duì)葡萄糖的利用速率，說(shuō)明酒精酵母對(duì)葡萄糖的嗜好性；隨著酵母菌株GGSF16接種量的增加，葡萄糖利用速率加快；整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，混合酵母菌株接種比例對(duì)果糖代謝的影響程度高于其對(duì)葡萄糖的影響程度.

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Discrepancy of fructose and glucose consumption during alcoholic fermentation by mixed strains

HUAN Qiong-sha， WU Shi-hua﹡， ZHAO Dong-ling， HUANG Cui-ji， YI Yi

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and

Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract：To provide basic information of sugarcane and cassava fermentation， the inoculation proportion of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 was evaluated to verify the use of glucose and fructose. The glucose and fructose medium （the total concentration was 220 g/L） with same concentration was used to conduct alcoholic fermentation. We adjusted the ratios of mixed strains of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 （10∶0， 8∶2，6∶4，4∶6， 2∶8， 0∶10） to conduct alcoholic fermentation， determining total sugar， glucose， fructose and ethanol in the fermentation process， using area under the curve（AUC） and complete/half metabolism time methods to analyze the difference of the utilization between the glucose and the fructose. The results showed that the rate of utilization of fructose was less than the rate of utilization of glucose， with the number of S.cerevisiae GGSF16 increasing， the metabolism rate of glucose became faster， the effect of mixed yeast strain on fructose metabolism was higher than that of glucose， the inoculation ratio of two yeast strains had no significant effect on ethanol production， the 0∶10 group had the highest total sugar fermentation efficiency and consumption of sugar fermentation efficiency. Thus， the best vaccination ratio of Saccharomyces cerevisiae GJ2008 and Saccharomyces cerevisiae GGSF16 was 0∶10.

Key words：mixed strains； fructose； glucose； area under the curve； alcohol fermentation

（學(xué)科編輯：黎 婭）