高美玲 劉陽 于海寧 侯紅漫 包永明

摘要[目的]研究層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）原生質體的最佳條件，建立高效制備層出鐮孢菌原生質體制備的方法。[方法]通過對菌絲體菌齡、酶解液組合、酶解反應溫度及酶解時間等影響因素進行優(yōu)化，對層出鐮孢菌原生質體的制備條件進行研究。[結果]菌塊在CMC液體培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)分生孢子3 d后，過濾離心后轉移至YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，該菌絲最適于層出鐮孢菌原生質體的制備；用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩潰酶、0.05 mg/mL溶壁酶的酶解液在30 ℃下對菌絲酶解1.5 h，此時原生質體的數量最大，為2.47×109 個/mL。原生質體再生培養(yǎng)時，使用40% PTC溶液恢復細胞壁，在TB3液體培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)，離心后與TB3固體培養(yǎng)基混合后倒入平板培養(yǎng)，原生質體再生率可達39.75%。[結論]通過對菌絲體菌齡、酶解液濃度、溫度、酶解時間等條件的優(yōu)化，可提高層出鐮孢菌原生質體的產量及再生率，為進一步研究層出鐮孢菌致病分子機制提供理論依據。

關鍵詞層出鐮孢菌；原生質體制備；原生質體再生；優(yōu)化

中圖分類號S432.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）35-0149-03

Abstract[Objective] The aim was to study the optimum conditions for the preparation of protoplasts of Fusarium proliferatum， and to establish efficient methods for preparing protoplast. [Method] The preparation conditions of protoplast of Fusarium proliferatum were studied by optimizing the factors including the hypha culture time， enzyme mixtures， enzymolysis reaction temperature and enzymolysis time. [Result] The result showed that mycelia was cultured in CMC liquid medium for three days at 25 ℃， and then the conidia was transferred to YEPD liquid medium for 12 hours， which was suitable for the preparation of protoplast of Fusarium proliferatum；The enzyme mixture containing 5 mg/mL lysing enzyme， 25 mg/mL driselase and 0.05 mg/mL lywallzyme was dissolved in 1.2 mol/L KCl solution；The enzymolysis reaction temperature was 30 ℃ and enzymolysis time was 1.5 h， the yield of protoplast was the highest， and the number of protoplasts was 2.47×109 protoplasts/mL. When the protoplast was regenerated， 40% PTC solution was used to restore the cell wall， and incubated in TB3 liquid medium at 30 ℃ overnight. After centrifugation， the cells were mixed with TB3 solid medium and poured into plate culture. The protoplast regeneration rate was 39.75%. [Conclusion] The yield and regeneration rate of protoplast of Fusarium proliferatum were improved by optimizing the conditions such as hypha culture time， enzyme mixtures， enzymolysis reaction temperature and enzymolysis time， and also provide theory basis for further study on pathogenicity molecular mechanism of Fusarium proliferatum.

Key wordsFusarium proliferatum；Protoplast preparation；Protoplast regeneration；Optimization

層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）是一種世界范圍內導致眾多糧谷類植物病害的重要病原菌，并具有廣泛的宿主范圍，該病原菌可引起番茄葉斑病[1]、玉米穗腐病[2]、大豆根腐病[3]等。層出鐮孢菌代謝過程中產生多種有害的真菌毒素，對多種作物的食品安全性構成威脅，也是生產上較難防治的重要病害之一。由于鐮孢菌種類較多，同屬不同種鐮孢菌在生物學特性、遺傳多態(tài)性和致病機理等方面也存在較大差異。目前，國內外對層出鐮孢菌的研究多集中于病原菌鑒定分類[4-7]、生物學特性[8]、毒素[9-10]等方面，但對層出鐮孢菌原生質體制備尚未見系統(tǒng)的研究報道，這在一定程度上限制了從分子水平對層出鐮孢菌進行深入的研究。因此，建立一種高效、穩(wěn)定的層出鐮孢菌原生質體制備方法，有利于對層出鐮孢菌進行功能基因組學的研究及其侵染植物宿主時產生的致病因子及效應子進行深入的分子機制研究。

筆者采用菌絲體酶解法對層出鐮孢菌原生質體制備過程中菌齡、酶解液組合、酶解反應溫度、酶解時間等條件進行優(yōu)化，建立一套適用于層出鐮孢菌原生質體制備及再生的方法，用于后期研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。層出鐮孢菌，菌株編號為K140108，分離自遼寧省大連綠晨水果蔬菜合作社（121°26E，38°89N）番茄溫室大棚的病葉，經單孢分離后，由大連理工大學生命科學與技術學院基因工程實驗室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基。PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L；CMC液體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素（CMC）15 g/L，硝酸銨（NH4NO3）1 g/L，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1 g/L，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g/L，酵母提取物1 g/L；YEPD液體培養(yǎng)基：酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；TB3液體培養(yǎng)基：酵母提取物3 g/L，酸水解酪蛋白3 g/L，蔗糖300 g/L；TB3固體培養(yǎng)基：酵母提取物3 g/L，酸水解酪蛋白3 g/L，蔗糖200 g/L，瓊脂10 g/L。以上培養(yǎng)基配制后，121 ℃高壓滅菌20 min備用。

1.1.3

主要試劑。酶解液：用10 mL 1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/mL裂解酶（Lysing enzyme，Sigma公司），25 mg/mL崩潰酶（Driselase，Sigma公司）及0.05 mg/mL溶壁酶（Lywallzyme）的酶解液，室溫下175 r/min振蕩30 min，4 000 r/min離心8 min，用0.22 μm 細菌過濾器過濾除菌后備用。

STC 緩沖液：蔗糖100 g，0.5 mol/L Tris-HCl（pH 80）50 mL，CaCl2·2H2O 3.675 5 g，加ddH2O定容至500 mL，混勻后121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃保存。

PTC緩沖液：稱取40 g PEG 8000，溶解于STC緩沖液中，定容至100 mL，65 ℃水浴鍋加熱完全溶解后，用0.22 μm細菌過濾器過濾除菌，4 ℃保存。

1.2方法

1.2.1菌體培養(yǎng)。從保存于斜面上的菌株中挑選少量菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基上進行活化，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，用接種環(huán)取4塊直徑為5 cm的菌絲塊接種至100 mL CMC液體培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖動培養(yǎng)。用無菌microcloth過濾培養(yǎng)3 d的孢子懸浮液于50 mL無菌離心管中4 000 r/min離心8 min，倒掉上清液，用YEPD液體培養(yǎng)基重新懸浮孢子，25 ℃、150 r/min搖動培養(yǎng)，用于后續(xù)原生質體的制備。

1.2.2原生質體制備。取YEPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲分別用雙層無菌microcloth中間夾3層無菌擦鏡紙進行過濾，再用無菌水洗滌2次后，各取0.5 g轉移至裝有10 mL酶解液的離心管中，30 ℃、90 r/min搖動培養(yǎng)酶解菌絲壁釋放原生質體，每隔0.5 h取20 μL用血球計數板在顯微鏡下觀察計數；停止酶解后，用1層無菌microcloth和2層擦鏡紙過濾酶解混合物到無菌50 mL離心管中，并用1.2 mol/L KCl緩沖液沖洗，盡可能將原生質體洗下來；室溫下4 000 r/min離心8 min，倒掉上清液；加入10 mL STC緩沖液輕微重懸，4 000 r/min離心8 min；去上清液后，沉淀即為原生質體，再重懸于1 mL STC緩沖液中，然后用血球計數板在顯微鏡下觀察，進行計數；用STC緩沖液將原生質體懸液稀釋至1×107 個/mL。

1.2.3原生質體制備條件的優(yōu)化。

1.2.3.1菌齡。在YEPD液體培養(yǎng)基中分別取培養(yǎng)時間為8、12、16、20、24 h的菌絲過濾用于原生質的制備。

1.2.3.2酶解液組合。用不同組合的酶酶解培養(yǎng)時間為12 h菌絲，分別為：①5 mg/mL裂解酶；②5 mg/mL裂解酶+0.05 mg/mL溶壁酶；③25 mg/mL崩潰酶；④5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩潰酶；⑤25 mg/mL崩潰酶+0.05 mg/mL溶壁酶；⑥5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩潰酶+0.05 mg/mL溶壁酶。

1.2.3.3

酶解反應溫度。用3種混合酶對12 h的菌絲酶解2 h，酶解溫度分別為20、25、30、35和40 ℃。

1.2.3.4酶解時間。

用3種混合酶對12 h的菌絲進行酶解，酶解時間分別為30、60、90、120、150 min。

1.2.4原生質體再生。取200 μL制備好的原生質體稀釋液，加入1 mL 40% PTC緩沖液用于恢復細胞壁，輕柔混合均勻，室溫靜置20 min后，再加入10 mL TB3液體培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下90 r/min搖床過夜培養(yǎng)；4 000 r/min離心8 min，棄去上清液，加入15 mL 55 ℃的TB3固體培養(yǎng)基，混勻后倒入平板，25 ℃下培養(yǎng)2～3 d平板上會長出單菌落，計數，并計算原生質體再生率。加入上述原生質體稀釋液同樣體積的無菌水作為對照組，進行如上操作后，涂布于TB3固體培養(yǎng)基作為對照組。每個試驗重復3次，取3次結果的平均值。

原生質體再生率=（原生質體再生菌落數-對照組菌落數）/原生質體總數×100%

2結果與分析

2.1層出鐮孢菌菌齡對原生質體制備的影響

處于不同生理時期和狀態(tài)的層出鐮孢菌菌絲對裂解酶的敏感性有較大的差異。因此，要保證菌絲體生理狀態(tài)相對一致的生長期。李華等[11]報道，對數生長期的菌體代謝旺盛，并且對酶的敏感性強，比穩(wěn)定期及衰亡期更適用于原生質體的制備。因此，該試驗將斜面上的菌株接到PDA固體培養(yǎng)基上進行活化后，接到CMC液體培養(yǎng)基中搖孢子，再接到YEPD液培養(yǎng)基中，目的是使孢子能夠同時萌發(fā)生成時期一致的菌絲，培養(yǎng)8 h開始，每隔4 h取100 mL過濾菌絲制備原生質體，結果見圖1，在12 h時獲得的原生質體數量最大，16～20 h時，在顯微鏡下觀察原生質體數量越來越少，24 h時發(fā)現很多菌絲體生長時間過長，菌壁較厚，裂解不完全，故原生質體的數量明顯下降。

2.2不同酶解液組合對層出鐮孢菌原生質體制備的影響

采用6種酶解液組合對培養(yǎng)12 h的層出鐮孢菌菌絲進行酶裂解，使溶解菌體細胞壁釋放出原生質體。結果見表1，單一使用裂解酶、崩潰酶的裂解效率遠不如酶組合。當5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩潰酶、0.05 mg/mL溶壁酶3種酶共同作用時，裂解最完全，而且比其他酶組合裂解所用的時間少，釋放出來的原生質體數量最多，可達22.43×108 個/mL。

2.3酶解溫度對層出鐮孢菌原生質體制備的影響

酶的活性對溫度較為敏感，因此，酶解溫度對酶解液裂解菌絲的速率有直接的影響。在適宜的溫度條件下，酶活性高，有利于提高原生質體的產量。該試驗用5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩潰酶+0.05 mg/mL溶壁酶這一組合的酶解液處理菌齡為12 h的菌絲。結果表明，層出鐮孢菌原生質體的產量隨著溫度的升高而不斷增加，在30 ℃時達到最高，但在30 ℃以后，隨著溫度的升高，原生質體的得率呈下降趨勢（圖2）。由此可見，30 ℃條件最適合酶解液裂解菌絲，獲得的原生質體數目最高。

2.4酶解時間對層出鐮孢菌原生質體制備的影響

酶解時間的長短對原生質體的釋放和再生有直接的影響，酶解時間短，菌絲壁不能完全裂解，釋放的原生質體數目較少，但酶解時間過長，則會出現原生質體破裂的現象，從而導致原生質體不能再生，因此，選擇適宜的酶解時間尤為重要。在30 ℃條件下，使用3種酶混合裂解液對菌齡為12 h的菌絲進行酶解。由圖3可知，30 min時在顯微鏡下觀察到未被酶解的菌絲較多，有極少數原生質體被釋放出來；隨著酶解時間的逐漸增加，釋放出的原生質體數目增加，在90 min時獲得的原生質體數量最多，120 min后原生質體的數量明顯下降。在顯微鏡下觀察（圖4），90 min是層出鐮孢菌裂解原生質體的最佳時間。

2.5層出鐮孢菌原生質體的再生

將制備好的原生質體在25 ℃下緩慢振蕩過夜培養(yǎng)，TB3液體培養(yǎng)基可以很好地維持原生質體的滲透壓，為原生質體再生提供有利條件。將再生的原生體懸浮于TB3固體培養(yǎng)基，24 h后可肉眼觀察到菌絲在培養(yǎng)基表面長出，原生質體再生率可達39.75%。

45卷35期高美玲等層出鐮孢菌原生質體制備條件的研究

3結論與討論

層出鐮孢菌K140108是從番茄病葉上分離出的一株致病性較強的病原菌，已通過RNA-Seq技術對該病原菌與宿主互作時產生的致病基因和效應基因進行分析，因此，建立和制備高效大量的層出鐮孢菌原生質體用于致病基因和效應基因的功能驗證尤為重要。目前，鐮孢菌屬中已有很多菌種制備出高效的原生質體，如禾谷鐮孢菌[12]、尖孢鐮孢菌[13]等。但鐮孢菌種類較多，同屬不同種的鐮孢菌在制備原生質體的方法上也存在一定差異。因此，通過研究酶解法制備層出鐮孢菌的原生質體，可用于后續(xù)該菌的致病基因功能研究。

菌絲體菌齡、酶解液組合、酶解反應溫度和酶解時間是影響原生質體數量的重要因素。為獲得高質量的層出鐮孢菌原生質體，該研究對以上4個因素逐一進行研究。結果表明，將在PDA培養(yǎng)基上活化的菌絲塊接到CMC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d可獲得大量分生孢子，再將其懸浮于YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，此時獲得的菌絲生長階段一致，并且此時的菌體幼嫩，細胞壁易于酶解。在研究酶解液組合因素時，該試驗對單一酶和混合酶進行比較。結果表明，裂解酶和崩潰酶分別使用時均可以裂解得到原生質體，但酶解效率遠不如兩者混合使用。此外，單一酶裂解用時較長，甚至會使原生質體破裂。當裂解酶、崩潰酶和溶壁酶共同使用時，原生質體的數量達到最高。在確定了菌體菌齡和酶解液組合的基礎上，該試驗還研究了酶解溫度和時間對原生質體數量的影響。酶解液的活性受溫度的直接影響，適宜的酶解溫度可使酶解液的活性達到最高[14]。該研究結果表明，30 ℃時酶解90 min可得到最大數目的原生質體，并且再生率可達3975%。

該研究中層出鐮孢菌原生質體制備的最佳條件如下：5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩潰酶、0.05 mg/mL溶壁酶的酶解液組合在30 ℃下對在YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌齡為12 h的菌絲酶解90 min，獲得原生質體的數目最大，為2.47×109 個/mL，原生質體再生率為39.75%，可用于對層出鐮孢菌中致病基因和效應基因的功能驗證。

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