劉祥 劉淑瑛 虎娟 張虹 張自萍 陳任

摘 要 杜仲生產(chǎn)的反式-1，4-聚異戊二烯橡膠（杜仲膠）是由異戊二烯單元聚合形成的不同分子大小的混合物，主要沉積于細(xì)胞的空隙之間，提取困難。為正確分析測(cè)定杜仲材料中杜仲膠的含量，以杜仲果翅為材料，采用氯仿、石油醚和甲苯3種有機(jī)溶劑，配合超聲波處理組成6種不同的提取方法，以杜仲膠的提取得率以及分子量分布為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)杜仲膠的分析測(cè)定方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，采用氯仿作為有機(jī)溶劑，杜仲膠提取得率明顯高于其他方法，可達(dá)到7.47%；氯仿配合超聲波處理，會(huì)更進(jìn)一步促進(jìn)小分子或大分子杜仲膠聚合物的溶出和提取，所得杜仲膠的分子量分布范圍更寬，分子量分布指數(shù)可達(dá)9.99。

關(guān)鍵詞 杜仲；杜仲膠；反式-1，4-聚異戊二烯；有機(jī)溶劑；索氏提取法；分子量分布；凝膠滲透色譜

中圖分類(lèi)號(hào) Q946.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The trans-1，4-polyisoprene rubber produced by Eucommia ulmoides Oliver（Eucommia-rubber）， which consists of different molecular sizes of polymers polymerized from the isoprene units， mainly accumulates in the cell gaps and is difficult to extract. To develop an effective method for the analysis of eucommia-rubber from E. ulmoides， the winged perianths were used as the material， and six pressing methods comprised three kinds of organic solvents， chloroform， petroleum ether and toluene assisted sonication were tested. The extraction efficiency was evaluated by the extraction rate and the molecular weight distribution of extracted eucommia-rubber. The results showed that using chloroform as the organic solvent， the extraction rate was 7.47%， which was significant higher than others， and using chloroform assisted sonication， a quantity of small and big molecular of eucommia-rubber could be more efficiently dissolved and extracted， reflecting that its molecular weight distribution index was up to 9.99. Our research would supply a favorable technique for the extraction and analysis of trans-polyisoprene rubber.

Key words Eucommia ulmoides； eucommia-rubber； trans-polyisoprene； organic solvent； soxhlet extraction； molecular weight distribution； gel permeation chromatography

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.021

天然橡膠是事關(guān)國(guó)計(jì)民生和國(guó)家安全的重要戰(zhàn)略物資，與石油、鐵礦石、有色金屬并稱四大工業(yè)原料。天然橡膠的主要成分為1，4-聚異戊二烯（1，4-polyisoprene），根據(jù)其聚合方式，有順式（cis-）和反式（trans-）兩種同分異構(gòu)體[1-2]。具有順式-1，4-聚異戊二烯生物合成能力的植物較多，最著名的且唯一在生產(chǎn)上應(yīng)用的是適合于熱帶地區(qū)種植的巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）。而具有反式-1，4-聚異戊二烯生物合成能力的植物極少，只有巴拉塔樹(shù)（Mimusops balata Crueg. ex Griseb.）、古塔波橡膠樹(shù)（Palaquium gutta Baill）[3-4]和杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）[5-6]等數(shù)種。反式-1，4-聚異戊二烯橡膠不同于順式-1，4-聚異戊二烯橡膠具有彈性，是一種類(lèi)似于硬質(zhì)塑料的堅(jiān)韌物質(zhì)，因絕緣性好，具有耐磨、耐酸堿、抗撞擊等特點(diǎn)，是制造海底電纜、工業(yè)填充材料的優(yōu)良原料[7-9]。另外，由于近年來(lái)我國(guó)在杜仲反式-1，4-聚異戊二烯橡膠（杜仲膠，Eucommia-rubber）的加工工藝上取得了突破，利用杜仲膠獨(dú)具的橡（膠）塑（料）二重性，通過(guò)控制硫化交聯(lián)度的高低可以把杜仲膠分別改造成為熱塑性、熱彈性和高彈性材料，不僅可以作為彈性的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠的替代品，而且與塑料、其他橡膠混合使用，在高速節(jié)能輪胎、納米磁性導(dǎo)電材料、形狀記憶塑料、新型醫(yī)用材料、防輻射材料以及聲納吸收和反射材料等特殊方面的用途不斷被研發(fā)出來(lái)，應(yīng)用前景非常廣闊[10-13]。

在杜仲遺傳改良等科研和生產(chǎn)實(shí)踐中，經(jīng)常需要評(píng)價(jià)杜仲不同產(chǎn)地、不同植株或不同組織之間杜仲膠含量的差異。但是，由于杜仲的韌皮部沒(méi)有乳管結(jié)構(gòu)，杜仲膠主要沉積于細(xì)胞的空隙之間，提取分離比較困難[14]。而且聚異戊二烯不是單一分子構(gòu)成的物質(zhì)，而是由異戊二烯單元（isoprene unit， C5H8）聚合形成的不同分子大小的混合物，分子量分布一般在103～106之間[5]，故從杜仲植物體內(nèi)或組織內(nèi)提取和分析杜仲膠含量時(shí)需要關(guān)注兩個(gè)指標(biāo)，即杜仲膠的提取量（或稱為得率）以及提取到的杜仲膠的分子量。二者既是評(píng)價(jià)杜仲植株或組織生產(chǎn)杜仲膠的數(shù)量和質(zhì)量，也是反映分析測(cè)定方法優(yōu)劣的指標(biāo)。譬如采用不同提取方法分析同一材料時(shí)，如果提取得率越高，分子量分布越寬，則說(shuō)明提取越充分，分析結(jié)果越準(zhǔn)確。目前對(duì)杜仲膠的分析測(cè)定主要側(cè)重于提取量（以此計(jì)算含膠量），而同時(shí)兼顧到這兩個(gè)指標(biāo)的提取和分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以杜仲果翅（或稱種莢）為材料，利用3種有機(jī)溶劑，配合超聲波處理組成6種不同的提取方法，以杜仲膠的提取得率以及分子量分布為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較，為正確分析測(cè)定杜仲植株或組織材料中的杜仲膠含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 果實(shí)成熟后于10月底采收陰干，保存于-85 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑 石油醚（天津富宇精細(xì)化工有限公司，分析純，沸程為90～120 ℃）、甲苯（天津富宇精細(xì)化工，分析純）、甲醇（天津富宇精細(xì)化工，分析純）、無(wú)水乙醇（天津富宇精細(xì)化工，分析純）、氫氧化鈉（西隴化工，分析純），氯仿（美國(guó)邁瑞達(dá)，色譜純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平（美國(guó)奧豪斯儀器，CP224C），索氏提取器（規(guī)格為250 mL），超聲波清洗器（寧波新芝生物科技，SB5200），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器，RE-52A），真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器，DZF-6021），凝膠滲透色譜儀（日本東曹，HLC-8320GPC）。

1.2 方法

1.2.1 材料研磨處理 杜仲果實(shí)去除種子，剝出果翅冷凍干燥一晚后，用液氮輔助充分研磨，精確稱取6份樣品，重量各為1 g。

1.2.2 材料堿處理 將每份樣品浸泡于10%的氫氧化鈉沸水浴中，處理3 h，用去離子水沖洗沉渣至中性后，40 ℃低溫下烘干。

1.2.3 材料乙醇處理 每份樣品繼續(xù)加入100 mL無(wú)水乙醇，連接索氏提取器進(jìn)行沸水浴處理6 h后，低溫烘干。

1.2.4 杜仲膠提取 利用3種有機(jī)溶劑，配合超聲波處理組成以下6種不同的方法溶解、提取樣品中的杜仲膠。方法1：加入100 mL氯仿，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法2：加入100 mL氯仿，60 ℃，40 kHz超聲波處理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法3：加入100 mL石油醚，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法4：加入100 mL石油醚，60 ℃，40 kHz超聲波處理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法5：加入100 mL甲苯，在80 ℃水浴下索氏提取6 h；方法6：加入100 mL甲苯，60 ℃，40 kHz超聲波處理40 min后，在80 ℃水浴下索氏提取6 h。

1.2.5 杜仲膠精制 將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min離心數(shù)次至干燥狀，收集提取液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液蒸干，真空干燥。加入5 mL甲醇潤(rùn)洗數(shù)分鐘，再次真空干燥即得到精制的杜仲膠制品，精確稱其重量。

1.2.6 杜仲膠提取得率分析 計(jì)算方法如下：

n=W1/W0×100%

式中n為杜仲膠提取得率（%）；W1為提取精制后的杜仲膠質(zhì)量（g）；W0為杜仲樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.7 杜仲膠的分子量分布分析 稱取0.02 g精制的杜仲膠制品，加入10 mL氯仿（流動(dòng)相），密封并遮光使之溶解約12 h后，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到2 mg/mL的樣品溶液。利用凝膠滲透色譜（GPC）儀進(jìn)行分子量分布分析。

標(biāo)準(zhǔn)溶液，已知Mw為1.0×103～1.2×106的cis-1，4-Polyisoprene標(biāo)準(zhǔn)品，加入氯仿（流動(dòng)相）制成的1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

凝膠滲透色譜分析條件，系統(tǒng)：Eco SEC-Work Station；色譜柱：PL gel MIXED-B（10 μm， 7.5×300 mm）；流動(dòng)相：氯仿；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器（RI）；進(jìn)樣量：樣品溶液70 μL（2 mg/mL），標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL（1 mg/mL）；洗脫時(shí)間：30 min。

根據(jù)GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的保留時(shí)間，每一樣品的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）以及分子量分布指數(shù)（Mw / Mn）由儀器軟件自動(dòng)計(jì)算并輸出。在Excel中繪制微分分子量分布曲線圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

杜仲膠提取得率以及分子量分布等數(shù)據(jù)處理 每種實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件（美國(guó)IBM）進(jìn)行方差分析和Duncan多重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料預(yù)處理結(jié)果

杜仲果實(shí)去除種子，剝出果翅后，經(jīng)充分研磨，可以見(jiàn)到白色膠絲外漏。用氫氧化鈉堿性溶液沸水處理后，果翅的角質(zhì)層、細(xì)胞壁的纖維溶解。隨后采用索氏提取器進(jìn)行乙醇處理后，葉綠素等醇溶性小分子物質(zhì)分離，沉淀物從略帶綠色逐漸轉(zhuǎn)為白色。

2.2 杜仲膠提取純化

利用甲苯、石油醚、氯仿作為有機(jī)溶劑，配合超聲波處理組成6種不同的方法對(duì)預(yù)處理后的沉淀物進(jìn)行溶解提取、干燥、精制，可得到杜仲膠精制品。根據(jù)提取得率的方差分析，3種有機(jī)溶劑對(duì)杜仲膠的提取得率有極顯著影響（P=0.000 03<0.05），且有機(jī)溶劑與超聲波處理之間有極顯著的交互作用（P=0.000 89<0.05）。從各種方法的平均提取得率的差異性檢驗(yàn)（圖1）可以看出，采用氯仿作為有機(jī)溶劑（方法1和方法2）提取得率明顯高于其他方法（平均提取得率分別達(dá)到7.48%和7.35%），此時(shí)是否配合超聲波處理對(duì)提取得率的影響不大；采用石油醚作為有機(jī)溶劑（方法3和方法4）時(shí)，超聲波處理能顯著提高提取得率（平均提取得率分別為5.54%和6.68%），而采用甲苯作為有機(jī)溶劑（方法5和方法6）時(shí)，超聲波處理反而會(huì)降低提取得率（平均提取得率分別為6.51%和5.44%）。

2.3 杜仲膠的分子量分布

利用凝膠滲透色譜儀對(duì)上述6種不同方法提取純化的杜仲膠進(jìn)行分子量分布分析。從各處理所得的杜仲膠微分分子量分布曲線（圖2）可以看出，杜仲果翅中的杜仲膠為單峰分布的高分子聚合物，分子量分布介于104～107之間。從各處理所得的杜仲膠的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）以及分子量分布指數(shù)（Mw / Mn）的情況（表1）可以看出，采用同一有機(jī)溶劑，未經(jīng)過(guò)超聲處理提取的杜仲膠的數(shù)均分子量明顯大于超聲處理的樣品，而重均分子量則相反；經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品提取的杜仲膠的分子量分布指數(shù)明顯大于未經(jīng)超聲處理的樣品。采用氯仿作為有機(jī)溶劑配合超聲波處理（方法2）提取的杜仲膠的分子量分布指數(shù)最大，達(dá)到9.99。

分子量分布指數(shù)是描述聚合物分子量的分布寬度或分散程度的指標(biāo)。該數(shù)值大表明聚合物分子量的分散性大，即超聲波處理所得杜仲膠的分子量分布范圍較寬，部分小分子或大分子的膠也能得到充分提取。

3 討論

綜合杜仲膠提取得率以及分子量分布兩個(gè)指標(biāo)，本研究對(duì)杜仲膠分析測(cè)定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，采用氯仿作為有機(jī)溶劑，配合超聲波處理，在水浴下采用索氏提取杜仲膠的分析效果最佳，此方法的提取得率為7.48%，相比于之前報(bào)道的用石油醚提取杜仲翅果獲得的5.47%[15]有較大進(jìn)步。在提取過(guò)程中使用超聲波輔助處理，可以進(jìn)一步促進(jìn)小分子或大分子杜仲膠聚合物的溶出，提取更加充分。這兩個(gè)指標(biāo)也是評(píng)價(jià)杜仲各種資源植株生產(chǎn)杜仲膠的數(shù)量和質(zhì)量的重要依據(jù)，后者與杜仲膠的物理性能和使用性能密切相關(guān)[16]。

目前杜仲膠含量的分析測(cè)定主要采用堿液浸提法，溶劑浸提法，高溫裂解法[17-19]等。堿液浸提法提取杜仲膠的效率較低；有機(jī)溶劑浸提法可以有效破壞細(xì)胞壁中的纖維素成分，但是不容易溶解果膠，影響膠絲分離；高溫裂解法操作比較復(fù)雜，這些缺點(diǎn)都會(huì)降低杜仲膠的提取效率[17]。在本實(shí)驗(yàn)中采用綜合方法對(duì)杜仲果翅進(jìn)行杜仲膠的提取，首先在預(yù)處理中將果翅磨碎，初步暴露膠絲，然后用濃堿液蒸煮，降低角質(zhì)層的阻礙作用，促進(jìn)細(xì)胞壁的纖維分解降解，使得膠絲與果翅的其他雜質(zhì)進(jìn)一步分離。用無(wú)水乙醇處理去除果翅中的葉綠素等醇溶性小分子物質(zhì)。最后利用低極性的有機(jī)溶劑氯仿對(duì)杜仲膠進(jìn)行溶解、分離。同時(shí)在乙醇處理和氯仿提取的過(guò)程中，利用索氏提取器使溶劑蒸發(fā)后冷凝回流，達(dá)到重復(fù)浸提的效果，可以得到純度較高的杜仲膠。

但是，筆者發(fā)現(xiàn)索氏提取超過(guò)6 h后，杜仲膠的提取得率反而略有減少，特別是分子量分布變窄（數(shù)據(jù)未顯示）。該原因目前尚不清楚，可能與杜仲膠易于氧化有關(guān)。反式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子結(jié)構(gòu)的碳碳雙鍵含量比較多，鍵能低，在熱氧作用下比較活潑，容易發(fā)生斷鍵反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間的有機(jī)溶劑重復(fù)浸提可能破壞杜仲膠的分子鏈和結(jié)構(gòu)[12，20]。有報(bào)道提出在索氏提取過(guò)程中，向冷卻管充注氮?dú)庖苑乐苟胖倌z的氧化[16]。

杜仲是第四紀(jì)冰川殘留下來(lái)的孑遺植物，僅存于我國(guó)西北部分地區(qū)，是十分珍貴的天然資源。杜仲遺傳變異豐富、適應(yīng)性廣泛，是唯一一種適合于亞熱帶、溫帶乃至寒帶栽培的能夠生產(chǎn)反式-天然橡膠的植物[2]。我國(guó)是世界上最大的天然橡膠消費(fèi)國(guó)，但由于目前全世界的天然橡膠原料來(lái)源主要產(chǎn)自巴西橡膠樹(shù)，受該樹(shù)種熱帶生長(zhǎng)特性限制，我國(guó)適合種植的區(qū)域有限，產(chǎn)能?chē)?yán)重不足，目前對(duì)進(jìn)口橡膠的依存度已高達(dá)80%，在不久的將來(lái)將嚴(yán)重制約我國(guó)橡膠工業(yè)的發(fā)展[8]。杜仲有望成為我國(guó)大部分地區(qū)能夠栽培的、解決我國(guó)天然橡膠貧乏的工業(yè)瓶頸的新資源。本實(shí)驗(yàn)以杜仲膠的提取得率以及分子量分布為衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)杜仲材料預(yù)處理、杜仲膠提取方法進(jìn)行比較，并利用凝膠滲透色譜儀進(jìn)行分子量分布分析，確定了有效的杜仲膠分析測(cè)定方法。該研究對(duì)天然橡膠、特別是杜仲反式-1，4-聚異戊二烯橡膠的提取和分析具有參考價(jià)值，在杜仲資源的培育以及杜仲資源的綜合開(kāi)發(fā)利用的科研和生產(chǎn)實(shí)踐中可用于測(cè)定杜仲植株或組織材料的反式-1，4-聚異戊二烯橡膠含量，判斷育種效果、栽培措施等對(duì)反式-1，4-聚異戊二烯橡膠生物合成的影響等。

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