吳國學 張振凌

摘要 目的：比較牛膝生品、蒸餾水炙品及不同乙醇濃度酒炙品指紋圖譜差異，研究不同乙醇濃度酒炮炙對牛膝飲片的影響。方法：采用HPLC，以島津VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長243 nm，進樣量15 μL，采集90 min。結果：牛膝各酒炙品大部分峰面積較生品的要稍高，蒸餾水炙品的較生品稍低，但不是很明顯。結論：酒炙有利于本實驗建立指紋圖譜中的牛膝大部分有效成分的溶出，高濃度乙醇炙品在有效成分溶出方面優(yōu)于低濃度乙醇炙品。

關鍵詞 牛膝；指紋圖譜；酒炙；HPLC；蛻皮甾酮；不同濃度乙醇

Abstract Objective：To compare the fingerprints among Medicinal Cyathula Root raw products， distilled by solid water and different concentrations of ethanol， so as to stud the effects of Medicinal Cyathula Root products processed by different concentration of ethanol. Methods：By using HPLC method， taking the SHIMADZU VP-ODS （4.6×250 mm， μm） as the chromatographic column， acetonitrile-water as mobile phase gradient elution， flow rate 0.8 mL/min， column temperature 25 ℃，detection wavelength 243 nm， sample volume 15 μL， acquisition for 90 min. Results：Most of the peak area of Medicinal Cyathula Root that processed by ethanol were slightly higher than raw products； raw products were lower than the distilled water products， but not very obviously. Conclusion：In this experiment， Medicinal Cyathula Root processed by ethanol is conducive to the dissolution of most active ingredient， high concentration ethanol processed product is better than the low concentration ethanol in the terms of the active ingredients dissolution.

Key Words Medicinal Cyathula Root； Fingerprints； Ethanol processing； HPLC； Ecdysterone； Different concentrations of ethanol

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.058

牛膝系莧科植物牛膝（Achyrabthes bidentate BL.）的干燥根，始載于《神農本草經》，并被列為上品。牛膝的主產地“河南溫縣、武陟、博愛、沁陽”舊稱懷慶府，故又稱懷牛膝，并為享有盛譽的“四大懷藥”之一。牛膝所含的化學成分比較多，主要為齊墩果酸型三萜皂苷類化合物、甾酮類化合物、多糖類化合物等化合物，另外還含有有機酸、生物堿、黃酮、環(huán)二肽、甾醇等[1]。本實驗采用高效液相色譜法比較不同輔料用酒炙牛膝及其生品飲片指紋圖譜的差異，判斷牛膝炮炙前后化學成分在種類和數量上的改變，初步評價牛膝炮炙作用，為牛膝炮制作用機制提供初步數據，并且對控制牛膝飲片質量，篩選炮炙輔料用酒提供初步依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜分析儀島津LC-20AT，SPD-20A檢測器，Chromato-Solution Light色譜數據處理系統(tǒng)，數控超聲波清洗器（KQ-500DV型，昆山市超聲儀器有限公司）。十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 試藥 藥材采購于亳州藥材市場，經河南中醫(yī)藥大學藥學院張振凌教授鑒定為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata BL.）的干燥根。其中牛膝生品、黃酒（16.5%）炙品、黃酒（16%）炙品、黃酒（22%）炙品、白酒炙品、蒸餾水炙品飲片均為按文獻[2]中1.1項下的方法制備的樣品，依將該批樣品編號為樣品“1，2，3，4，5，6”，即牛膝生品為1號、黃酒（16.5%）炙品為2號、黃酒（16%）炙品為3號、黃酒（22%）炙品為4號、白酒（56%）炙品為5號、蒸餾水炙品為6號。對照品：蛻皮甾酮（β-ecdysone）（批號：20070226）購于中國科學院昆明植物研究所，純度>98%。

1.3 試劑 甲醇（天津市永大化學試劑開發(fā)中心，批號：20080320，分析純），甲醇（天津市四友精密化學品有限公司，批號：080520，色譜純），乙腈（美國Tedia公司，批號：08045020，色譜純）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：島津VP-ODS（4.6×250 mm）；流動相：乙腈：水；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：243 nm；流動相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫：0.01～10 min：98-95A，10～20 min：95-95A，20～35 min：95-81A，35～50 min：81-81A，50～65 min：81-65A，65～80 min：65-58A；進樣量15 μL；采集90 min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蛻皮甾酮對照品5.03 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含蛻皮甾酮0.503 mg）。

2.3 供試品溶液的制備 取牛膝各樣品粉末（過20目篩）約5 g，精密稱定，加入50 mL甲醇超聲（500 w，40 kw）30 min，靜置后過濾，濾渣再加入甲醇50 mL，重復上面操作，過濾，并以少量甲醇分次洗滌容器和殘渣，合并過濾液，置水浴上揮發(fā)至干，殘渣加色譜甲醇定溶至10 mL容量瓶中，用0.45 μm為微孔濾膜過濾既得供試品溶液。

2.4 精密度試驗 精密吸取同一供試品[牛膝黃酒（22%）炙品]溶液15 μL，在2.1項色譜條件下連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖，計算各樣品中共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間的RSD≤1.68%，相對峰面積的RSD≤1.91%，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品試液[牛膝黃酒（22%）炙品]分別于制備后0、6、12、18、24、48 h在2.1項色譜條件下進樣15 μL，計算各樣品中共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間的RSD≤1.73%，相對峰面積的RSD≤1.66%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.6 重復性實驗 取同一批樣品[牛膝黃酒（22%）炙品]5份，每份約5.0 g，精密稱定，照2.3方法制成五份供試品溶液，按2.1項下的色譜條件，依次進樣15 μL，計算各樣品中共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰相對保留時間的RSD≤1.39%，相對峰面積的RSD≤1.76%，表明該方法重復性良好。

2.7 指紋圖譜的建立 分別將按2.3項下方法把牛膝生品、黃酒（16.5%）炙品、黃酒（16%）炙品、黃酒（22%）炙品、白酒（56%）炙品及蒸餾水炙品飲片制備成供試品溶液，并在2.1項色譜條件下進行進樣分析，按2.2項下制得蛻皮甾酮對照品同樣進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1、圖2。

2.8 共有峰的標定 分析牛膝各樣品指紋圖譜，確定共有峰10個。其中5號峰為蛻皮甾酮的峰。見圖3。該峰質量分數最高且比較穩(wěn)定，將其作為參比峰，計算其他各峰的相對保留時間、相對峰面積，結果見表1、表2。

2.9 相似度計算 利用Chromafinger 2005 Beta 0.1色譜軟件對牛膝生品、蒸餾水炙品及各酒炙品的指紋圖譜進行處理，得到各樣品指紋圖譜相似度分析結果。見表3。結果表明牛膝各樣品相似度>0.90，各樣品比較相似。用該軟件處理得出牛膝生品與各酒炙品飲片鏡像圖譜。見圖4（各對圖譜相似度均較高，僅選一對圖譜顯示），結果同樣顯示牛膝生品與各酒炙品飲片指紋圖譜相似較高。

從2.8項下的實驗數據分析，除4號、9號、3號（僅16%黃酒炙品）共有峰外牛膝各酒炙品其他共有峰相應的峰面積較生品的要稍高，除2號、9號共有峰外牛膝蒸餾水炙品的其他共有峰的峰面積較生品的要稍低，并且整體上各樣品大部分共有峰相應的峰面積隨炮炙用輔料用酒的濃度的提高而增高，但不是特別明顯。另外從本實驗的整個圖譜上來看，牛膝各樣品指紋圖譜相似度較高，在峰的數目和保留時間方面沒有太大改變。

3 討論

從圖譜分析發(fā)現，牛膝各樣品指紋圖譜沒有太大區(qū)別，只是在含量上稍有不同。生品與炙品，炙品之間的差別都不是太明顯，在峰的數目與保留時間方面沒有太大改變，經相似度計算表明，牛膝各飲片的相似性較好，相關系數和夾角余弦都>0.9，說明牛膝生品飲片與酒炙品飲片、酒炙品飲片之間無明顯差異，牛膝、酒牛膝飲片在本實驗建立的指紋圖譜上沒有太大的改變。有文獻報道牛膝生品飲片與各炮炙品飲片在蛻皮甾酮含量上的差別[2]，而通過本實驗得到的各樣品指紋圖譜蛻皮甾酮的峰面積基本與文獻報道的規(guī)律一致，即白酒（56%）炙品>黃酒（22%）炙品>黃酒（16%）炙品>黃酒（16.5%）炙品>生品>蒸餾水炙品，也就是蛻皮甾酮的含量隨著炮炙用酒乙醇濃度的提高而增高。

牛膝生品大部分共有峰的峰面積要比相應保留時間上炙品的要稍小，但不是很明顯，這可為牛膝酒炙后增強活血化瘀作用的機制提供實驗上的數據；另外酒味甘、辛，性大熱，酒炙過程中酒“能升能散、宣行藥勢”的藥性[3]可為酒炙能增加藥物溶出作用提供理論上的依據。牛膝蒸餾水炙品大部分共有峰的峰面積要比相應保留時間上生品的要小，這可能是牛膝生品飲片在與蒸餾水加熱的過程中，藥材中蛋白質的凝固以及淀粉粒的糊化影響了有效成分的溶出。實驗結果顯示大部分共有峰相應的峰面積隨著炮炙輔料中乙醇含量的升高而增加，這說明高乙醇濃度輔料用酒炮炙有利于本實驗建立的指紋圖譜中各成分的溶出，這為牛膝飲片炮炙輔料用酒的篩選提供一定的依據。

本實驗采用的檢測波長為243 nm，這個波長為蛻皮甾酮的檢測波長，因而在控制蛻皮甾酮的方面有著一定的作用。另外牛膝中還含有三萜皂苷、生物堿、多糖、黃酮、有機酸等成分，其中齊墩果酸的檢測波長為215 nm左右[4]；而甜菜堿在低紫外區(qū)195 nm才有吸收[5]，且其極性較大，需用正相柱，因而用該實驗建立的檢測條件不能同時監(jiān)控牛膝的各個成分，牛膝指紋圖譜有待進一步研究。鑒于蒸發(fā)光檢測器幾乎可以檢測所有的物質，因而在以后研究中可以考慮用HPLC-蒸發(fā)光散器來建立牛膝的指紋圖譜，該方法可為闡明牛膝酒炙炮制機制提供試驗參數；另外正相柱可更直觀的顯示牛膝酒炙前后水溶性成分的改變，因而今后的研究同時可以考慮建立牛膝正相柱的指紋圖譜，這也可為牛膝酒炙的炮制機制提供試驗數據，同時為牛膝、酒牛膝飲片的質量監(jiān)控提供參數。

參考文獻

[1]沈舒，王瓊，李友賓.牛膝的化學成分和藥理作用研究進展[J].海峽藥學，2011，23（11）：1-6.

[2]張振凌，吳國學，許真真，等.不同種類酒炮炙對牛膝飲片蛻皮甾酮含量的影響[J].中藥材，2009，32（9）：1369-1371.

[3]龔千鋒，丁安偉，孫秀梅，等.中藥炮制學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：167.

[4]張振凌，吳國學，李君麗.不同種類酒炮炙對牛膝飲片齊墩果酸含量的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（6）：39-41.

[5]趙素霞，吳國學，張振凌，等.不同種類酒炙對牛膝飲片甜菜堿含量的影響[J].中藥材，2011，34（5）：690-692.

（2017-02-08收稿 責任編輯：張文婷）