雷燕 肖洋 王娟 張文文 戚瑞榮 張會軍 王學鵬

摘要[目的]對江蘇省吳中地區(qū)養(yǎng)殖池塘患病的中華絨螯蟹進行診斷。[方法]結合臨床流行病學調(diào)查和分子生物學鑒定，對江蘇省吳中地區(qū)發(fā)病的中華絨螯蟹進行實驗室檢測與鑒定。參考GenBank中白斑癥病毒（WSSV）的基因序列設計1對特異性引物，以從中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺、肌肉等組織提取的DNA為模板，進行PCR擴增。[結果]經(jīng)過解剖觀察，發(fā)現(xiàn)病蟹內(nèi)臟器官無明顯變化。從病蟹的肝胰腺和肌肉中未分離到致病菌。通過PCR擴增，均能擴增出預期大小的特異性產(chǎn)物，測序比對顯示擴增條帶的基因序列與WSSV的基因序列同源性高達99.6%。病理切片顯示鰓和肝胰腺可見大量細胞核腫大細胞，與WSSV引起對蝦組織的病變相一致。[結論]經(jīng)初步診斷，確定引起中華絨螯蟹發(fā)病死亡的病原為WSSV。

關鍵詞中華絨螯蟹；白斑癥病毒；診斷；組織病理變化

中圖分類號S945.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0089-03

Abstract[Objective] To diagnose the diseased Eriocheir sinensis in culture pond of Wuzhong Region of Jiangsu Province. [Method] The laboratory detection and identification were made on diseased E. sinensis by using clinical epidemiological investigation and molecular biological identification. One pair of specific primers were designed according to WSSV sequence in GenBank. DNA was extracted from the gill， hepatopancreas， muscle and other organs of E. sinensis and taken as templates to make PCR amplification. [Result] It was found that there was no obvious change of visceral organs in diseased E. sinensis by anatomical observation. No pathogenic bacterium was isolated from liver and muscle of diseased E. sinensis. Specific products with predicted size were obtained from diseased E. sinensis by PCR. The sequencing comparison results showed that the homology of nucleotide sequences between the amplified brands and WSSV was 99.6%. By observing the pathological sections， it was found that there were a large number of cells with enlargement nucleus in the gill and liver of diseased E. sinensis， which was accordant with the lesions of shrimp infected by WSSV. [Conclusion] The pathogen of diseased E. sinensis was confirmed as WSSV by tentative diagnosis.

Key wordsEriocheir sinensis；White spot syndrome virus（WSSV）；Diagnosis；Histopathological changes

基金項目浙江省科技計劃項目（2012F20029）；中央財政支持地方高校發(fā)展專項學科項目；溫州市重點科技創(chuàng)新團隊項目（C2012004-02）；浙江省重大科技專項（2012C12017-3）；溫州市科技計劃項目（2011N0006）。

作者簡介雷燕（1983—），男，四川綿陽人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)動物病害研究。

通訊作者，副教授，博士，從事水生動物病害防控研究。

收稿日期2016-12-29

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹，隸屬甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriocheir），是一種重要的經(jīng)濟蟹類。我國中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，已經(jīng)形成規(guī)?；?。然而，細菌性疾病與病毒性疾病不斷發(fā)生[1-3]，嚴重影響中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖。隨著消費量的不斷增加，為了提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，在生產(chǎn)中常采用多品種混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，如克氏原螯蝦與中華絨螯蟹混養(yǎng)等[4]。然而，近年來，進入6月后經(jīng)常發(fā)生克氏原螯蝦大批量死亡后，處于相同養(yǎng)殖池塘中的中華絨螯蟹隨后出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，嚴重時整個池塘的克氏原螯蝦和中華絨螯蟹全部死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

2015年6月，江蘇省蘇州市吳中地區(qū)的克氏原螯蝦與中華絨螯蟹混養(yǎng)池塘的克氏原螯蝦出現(xiàn)大面積發(fā)病死亡，約7 d后大部分克氏原螯蝦發(fā)病池塘的中華絨螯蟹也出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象。發(fā)病河蟹的主要外觀癥狀為全身無力，解剖未見其他明顯病變。筆者參照文獻[5-6]從細菌學、病毒學和組織病理學3個方面對江蘇省吳中地區(qū)發(fā)病中華絨螯蟹進行實驗室檢測，并結合臨床流行病學調(diào)查及分子生物學鑒定對其進行鑒定。

1材料與方法

1.1試驗材料

發(fā)病中華絨螯蟹于2015年6月取自江蘇省蘇州市吳中地區(qū)部分克氏原螯蝦和中華絨螯蟹混養(yǎng)池塘，共選取10只發(fā)病的中華絨螯蟹；2只正常的中華絨螯蟹，采自江蘇省南京市某中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘。

2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker，均購自天根生化科技（北京）有限公司；營養(yǎng)瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設計。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的白斑癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）基因的保守序列，設計1對特異性的檢測引物序列，上游引物WSSV-F為5-GTGTACTAGGAATATTGGAAT-3；下游引物WSSV-R為5-CGGCATTCTTCATGGCTTCTG-3，預擴增片段長441 bp，引物由華大基因有限公司合成。

1.2.2流行病學調(diào)查及臨床檢查。

對發(fā)病養(yǎng)殖池塘的水溫、水質(zhì)指標、水源以及發(fā)病中華絨螯蟹苗種來源、傳染性、發(fā)病率和死亡率等進行現(xiàn)場調(diào)查，觀察發(fā)病中華絨螯蟹在養(yǎng)殖池塘中的活動情況，分別選取正常中華絨螯蟹和發(fā)病中華絨螯蟹，觀察其體表癥狀，然后打開中華絨螯蟹的背殼，觀察內(nèi)臟組織器官的病變情況。

1.2.3細菌檢查。

無菌條件下，分別從發(fā)病中華絨螯蟹和正常中華絨螯蟹的肝胰腺和肌肉中，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿進行細菌分離，將分離后的培養(yǎng)皿包裝好并帶回實驗室，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無細菌生長。

1.2.4DNA提取。

分別取中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺和肌肉等組織器官，用玻璃組織勻漿器研磨后置于-20 ℃冰箱中反復凍融3次，備用。DNA提取采用酚-氯仿法，提取的DNA于-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR檢測。

采用設計合成的特異性引物WSSV-F和WSSV-R，進行PCR擴增，PCR反應體系（20 μL）為：2×Taq PCR MasterMix 10.0 μL，滅菌雙蒸水6.0 μL，DNA模板3.0 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃循環(huán)變性30 s，56 ℃退火復性30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，反應結束后進行含EB（溴化乙錠）的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將陽性目的條帶利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，并將其送至華大基因有限公司進行測序，測序結果提交NCBI網(wǎng)站進行序列比對。

1.2.6病理學觀察。

在解剖并完成細菌分離培養(yǎng)后，分別取正常和發(fā)病的中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺組織，用波恩氏液固定，梯度酒精脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切片，厚度5～6 μm，最后用蘇木精-伊紅（H-E）染色，于Nikon E800 顯微鏡下觀察組織病變并拍照。

2結果與分析

2.1發(fā)病情況和流行病學調(diào)查

近年來，江蘇地區(qū)小龍蝦、河蟹混養(yǎng)池塘經(jīng)常發(fā)生小龍蝦發(fā)病大量死亡后中華絨螯蟹也大量死亡的情況，主要發(fā)生在每年6月，池塘水溫升至28 ℃左右，發(fā)病率為60%，發(fā)病池塘死亡率達80%，嚴重時養(yǎng)殖池塘每天死亡河蟹200～300只，直至全部死亡。發(fā)病過程中使用抗生素無明顯治療效果，使用水質(zhì)、底質(zhì)改良劑調(diào)水、改底有一定的效果。發(fā)病中華絨螯蟹趴在水草上，活力差，四肢無力，解剖各個內(nèi)臟組織器官無明顯病變。

2.2細菌的分離結果

從發(fā)病池塘選取的10只發(fā)病中華絨螯蟹的肝胰腺和肌肉接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h后，僅見2只中華絨螯蟹的肝胰腺中長出少量細菌；從正常中華絨螯蟹也未分離出細菌。

2.3病毒的PCR擴增結果

利用設計的特異性引物，以中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺、肌肉組織抽提的DNA為模板，進行PCR檢測，得到與預期目的條帶大小相符的特異性片段，其中10只發(fā)病中華絨螯蟹的組織病料中均能擴增出441 bp大小的目的條帶（圖1），而2只正常中華絨螯蟹未擴增出目的條帶。將擴增的陽性目的條帶送至華大基因有限公司進行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)該測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中WSSV的基因序列同源性為99.6%。

2.4組織病理變化觀察結果

染色后進行觀察，感染W(wǎng)SSV的中華絨毛蟹鰓內(nèi)可見大量細胞核腫大細胞，零星細胞壞死（圖2B、C）；肝胰腺腺管上皮中大量細胞核腫大細胞，腺管間少量細胞增生、增生細胞有壞死，腺管間輕微水腫（圖2E、F），而正常中華絨螯蟹的鰓（圖2A）和肝胰腺（圖2D）未見明顯病變。

3討論

白斑癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是當今對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害的最大的病毒[7-9]，目前已經(jīng)在我國蝦類養(yǎng)殖場中廣泛流行。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，WSSV的致病力呈增強的趨勢，其宿主范圍也在不斷擴大。

江蘇省是河蟹的主要養(yǎng)殖區(qū)域，近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，河蟹疾病也呈暴發(fā)性發(fā)生，每年進入6月后水溫升至28 ℃左右，養(yǎng)殖的小龍蝦和河蟹就陸續(xù)發(fā)病，死亡量巨大，使用各種抗生素無明顯效果，可能是病毒感染所致。

克氏原螯蝦是WSSV的易感宿主之一，曾作為WSSV的實驗動物模型[10-11]，因此在大力發(fā)展蝦蟹混養(yǎng)的同時，要注意防范WSSV帶來的風險。WSSV為一種無包涵體病毒，宿主范圍廣，流行范圍大，傳染性強，目前尚無有效的治療藥物，還不能有效地控制疫情。

WSSV主要侵害皮下組織、表皮角質(zhì)層組織、觸角腺、造血組織、鰓、血淋巴器官等組織器官，在對蝦嚴重患病組織中可見明顯的細胞核腫大細胞。對發(fā)病的中華絨螯蟹鰓和肝胰腺進行組織切片觀察，其鰓和肝胰腺均可見大量核腫大細胞，該病變與WSSV引起的蝦組織病變相一致。

該研究對江蘇省吳中地區(qū)的蝦蟹混養(yǎng)池塘的發(fā)病中華絨螯蟹進行了調(diào)查研究，通過流行病學、細菌學、病毒學和組織病理學3個方面的調(diào)查，確定引起中華絨螯蟹發(fā)病的病原為WSSV。該研究結果可為今后中華絨螯蟹養(yǎng)殖疾病的防控提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1] 姜靜穎，邢殿樓，王斌，等.池塘養(yǎng)殖中華絨螯蟹幼蟹的一種球狀病毒粒子的電鏡觀察[J].大連水產(chǎn)學院學報，1996，11（1）：51-53.

[2] 陸宏達，范麗萍，薛美.中華絨螯蟹小核糖核酸病毒病及其組織病理學[J].水產(chǎn)學報，1999，23（1）：61-68.

[3] 沈錦玉，尹文林，錢冬，等.中華絨螯蟹“腹水病”及“抖抖病”并發(fā)病病原的研究[J].中國水產(chǎn)科學，2000，7（3）：89-92.

[4] 嚴維輝，唐建清，劉煒，等.小龍蝦、河蟹與魚高效混養(yǎng)技術[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2008，29（2）：26-27.

[5] 雷燕，戚瑞榮，唐紹林，等.褐籃子魚虹彩病毒病的診斷[J].大連海洋大學學報，2014，29（3）：236-240.

[6] 雷燕，戚瑞榮，崔龍波，等.大口黑鱸魚種彈妝病毒病的診斷[J].大連海洋大學學報，2015，30（3）：305-308.

[7] 蔡生力，黃倢，王崇明，等.1993-1994年對蝦暴發(fā)病的流行病學研究[J].水產(chǎn)學報，1995，19（2）：112-117.

[8] INOUYE K，MIWA S，OSEKO N，et al.Mass mortalities of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicas in Japan in1993：Electron microscopic evidence of the causative virus[J].Fish pathology，1994，29（2）：149-158.

[9] LIGHTNER D V，REDMAN R M，POULOS B T，et al.Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp[J].Rev Sci Tech，1997，16（1）：146-160.

[10] 朱建中，陸承平.對蝦白斑綜合征病毒在螯蝦動物模型的感染特性[J].水產(chǎn)學報，2001，25（1）：47-51.

[11] 朱建中，陸承平.用動物模型檢驗消毒劑對對蝦白斑綜合征病毒的滅活效果[J].中國獸藥雜志，2001，35（2）：6-7.