秦緒偉 吳昊 王蕾 刁有祥
摘要:2017年3月,山東濰坊某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖肉鴨15000X,發(fā)生急性死亡、神經(jīng)癥狀、厭食為主要特征的疾病,經(jīng)實驗室解剖化驗、細菌的分離鑒定、分子生物學的鑒定,最終確診為鴨里默氏桿菌病,經(jīng)藥敏試驗,選擇敏感性高的藥物治療,最終控制了病情。
關鍵詞:鴨里默氏桿菌??;鑒定;毒力;藥敏
中圖分類號:S858.23 文獻標識碼:B 文章編號:2096-3637(2017)05-0002-03
鴨里氏桿菌病又稱為鴨傳染性漿膜炎,是由鴨疫里默氏桿菌引起的幼鴨的一種急性傳染病,主要侵害1~8周齡的小鴨,是造成幼鴨死亡的主要傳染病之一。鴨疫里默氏桿菌,菌體呈現(xiàn)桿狀或者橢圓,菌體大小為0.3~0.5×0.7~6.5um,也有的呈現(xiàn)長絲狀,可以達到11~24um。細菌少數(shù)呈現(xiàn)短鏈排列或者成雙排列,多數(shù)呈現(xiàn)單個存在,可形成莢膜,無鞭毛,革蘭氏染色呈現(xiàn)陰性,瑞氏染色可見細菌呈現(xiàn)兩極濃染。鴨疫里默氏桿菌的生長營養(yǎng)要求比較高,普通的瓊脂平板、麥康凱平板、SS瓊脂平板不生長,細菌分離時需要在5%二氧化碳環(huán)境中分離,37℃培養(yǎng)24h以上。
鴨疫里氏桿菌發(fā)病主要是發(fā)生在2~3周齡的小鴨,一年四季都有發(fā)生,各種應激都會促進疾病的發(fā)生,飼養(yǎng)密度大、環(huán)境衛(wèi)生差、飼養(yǎng)管理不善、維生素缺乏等原因都會造成疾病的發(fā)生,剖檢明顯癥狀以纖維素性心包炎、肝周炎,嚴重的引起氣囊炎以及有的發(fā)病鴨可以出現(xiàn)干酪性輸卵管炎、關節(jié)炎,死亡率高,耐過的鴨生長遲緩、飼料報酬低,該病成為養(yǎng)殖場養(yǎng)鴨業(yè)影響比較大疫病。
2017年3月,山東濰坊某肉鴨養(yǎng)殖場,養(yǎng)殖15日齡的肉鴨15000只,開始有少量死亡,每天死亡10只左右,未引起重視,以為環(huán)境變化、天氣原因引起的發(fā)病,發(fā)病都為急性死亡,3d后死亡率開始增加,每天死亡50多只、100多只,嚴重的死亡每天300只,發(fā)病表現(xiàn)有的精神萎靡、神經(jīng)癥狀、厭食、嗜睡、縮頸,部分發(fā)病的鴨子表現(xiàn)眼睛漿液性或者粘液性的分泌物,眼睛周圍羽毛脫落,鼻孔有粘液或者漿液性的分泌物,糞便稀薄,兩腿伸直或者尾部搖擺,不久后抽搐死亡。解剖可見急性病例心包液嚴重增多,心包外膜可見纖維素的滲出物,嚴重的整個心包都是纖維素包裹,纖維素滲出物呈現(xiàn)干酪樣。肝臟表面包裹一層灰白色黃色的纖維素膜,容易剝離,肝臟嚴重的腫大,質(zhì)地較脆易碎。氣囊全部渾濁,有纖維素膜。脾臟有的腫大,嚴重的有纖維素膜包裹,質(zhì)地易碎。養(yǎng)殖場發(fā)病后開始死亡較少未引起重視,后來發(fā)病增多,來實驗室化驗,最終經(jīng)細菌的分離鑒定、確診為鴨疫里默氏桿菌引起的鴨漿膜炎病,經(jīng)藥敏試驗選擇敏感的藥物,最終治療效果良好。后期還進行的鴨疫里默氏桿菌的生化試驗、PCR鑒定,細菌血清型的鑒定、細菌的毒力試驗,了解鴨疫里默氏桿菌的基本特性。
1材料和方法
1.1試驗菌株
山東某肉鴨養(yǎng)殖場,發(fā)生死亡的病例,臨床上急性發(fā)病,解剖可見嚴重的心包炎、肝周炎,疑似鴨疫里氏桿菌病,留取病料,細菌分離,作為實驗菌株。
1.2試驗動物
14日齡櫻桃谷鴨,購自德州臨邑某養(yǎng)殖場。
1.3器材
生物安全柜,購白蘇凈安泰;全自動樣品快速研磨儀,購自上海凈信科技;基因擴增儀,購自杭州博日科技有限公司;恒溫培養(yǎng)箱,購自三洋;顯微鏡,購自奧林巴斯。
營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂,馬丁肉湯粉,購自青島海博試劑公司;細菌微量生化反應小管,購自北京路橋試劑公司;微量藥敏片,購自杭州天和生物試劑有限司;犢牛血清,購自內(nèi)蒙古金源康試劑公司;革蘭氏染色液、瑞氏染色液,按照規(guī)程在實驗室自行配制;1型、2型、7型鴨疫里默氏桿菌陽性定型鑒定血清,齊魯動保研究所制備,已與標準品驗證;解剖臺、解剖刀、剪刀、酒精燈、接種環(huán)、試管、高壓鍋、超聲波清洗機,實驗室常備物品。
1.4細菌分離與鑒定
養(yǎng)殖場鴨子發(fā)生神經(jīng)癥狀、急性死亡的病例,解剖可見嚴重的包心包肝,無菌條件下進行肝臟的細菌分離,接種環(huán)挑取肝臟組織分別接種10%血清營養(yǎng)瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、ss瓊脂平板,放置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h-48h,觀察有無細菌生長,若有細菌生長則記錄細菌菌落的生長情況,進行細菌的革蘭氏染色、瑞氏染色,觀察細菌形態(tài)。
1.5生化試驗
將分離的疑似鴨疫里默氏桿菌從血清營養(yǎng)瓊脂平板挑取單個菌落,接種10%血清馬丁肉湯培養(yǎng)基,接種后37℃溫箱振蕩培養(yǎng)24h,取樣接種微量生化反應小管,接種后24h~48h觀察記錄結(jié)果。糖發(fā)酵試驗是將菌液接種糖發(fā)酵小管,每只管0.2ml,觀察7d;硫化氫試驗是將細菌穿刺接種醋酸鉛培養(yǎng)基,觀察培養(yǎng)基是否變黑;過氧化氫酶試驗,是用接種環(huán)取固體培養(yǎng)基上的菌落,置于潔凈的試管內(nèi),滴加2m13%過氧化氫,觀察是否有氣泡產(chǎn)生;甲基紅試驗是將細菌接種到蛋白胨水中,37℃培養(yǎng)24h,觀察顏色的變化。
1.6血清型鑒定
方法是使用平板凝集試驗,接種環(huán)挑取血清平板的單個菌落,與一滴血清1型、2型、7型陽性定型血清在玻璃平板上混合,混合后1min觀察有無凝集現(xiàn)象,如果與血清1型血清凝集則判定為1型鴨疫里默氏桿菌,如果與血清2型血清凝集則判定為2型鴨疫里默氏桿菌,血清7型血清凝集則判定為7型鴨疫里默氏桿菌。
1.7藥敏試驗
挑取血清瓊脂平板上的菌落,使用接種環(huán)挑取菌落在另外一個血清平板上均勻涂布,將有各種藥物的藥敏片貼于瓊脂上,置37%溫箱放置24h~48h,觀察抑菌圈的大小,確定藥物的敏感性。
1.8PCR病毒檢測
將發(fā)病鴨的肺臟、脾臟、肝臟適量研磨,凍融后進行基因擴增PCR檢測,檢測流感、腺病毒、黃病毒、鴨肝炎病毒。
1.9細菌16SrRNA
將血清平板分離的單個細菌接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基,溫箱37℃震蕩培養(yǎng)36h,取1ml,加熱煮沸7min,冰浴5min,離心取上清作為基因擴增的模板,設計引物:F1-5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.R1-5ACGGCTACCTTG TTG TTA CGA CTT-3,PCR反應體系(50u1):10*PCRBuffer(含MgC1215mmol/L,KC1500mmol/L)5ul,2.5mmol/LdNTP 4ul,引物(20umol/10各1ul,模板2ul,ddH2036.8ul,Taq酶(5U/u1)0.25ul。PCR反應條件:94℃5rain;94℃lmin,56℃30s,72℃1.5min,30個循環(huán);72℃10min。取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,測序公司檢測,根據(jù)測序結(jié)果Genbank比對,確定細菌為何種細菌。
1.10毒力試驗
將分離的1型鴨疫里默氏桿菌接種含有10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板,放置37℃溫箱培養(yǎng)48h后,接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基,37~C溫箱搖床培養(yǎng)36h,取菌液將菌液稀釋成1X108CFU/ml,5X107CFU/ml,2X107CFU/ml,1X107CFU/ml,進行肌肉注射14日齡的幼鴨5只,1ml/只,攻毒后觀察7d,記錄發(fā)病死亡情況,同時飼養(yǎng)5只同日齡幼鴨作為對照,若發(fā)現(xiàn)有扭頸、角弓反張的神經(jīng)癥狀則判定發(fā)病。
2結(jié)果
2.1細菌分離和培養(yǎng)特性結(jié)果
發(fā)生鴨子急性死亡病例,肝臟涂片革蘭氏染色鏡檢,可見陰性小桿菌。肝臟病料無菌接種血清營養(yǎng)瓊脂平板,在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)約36h可見細小的菌落生長,透明露珠樣菌落,平板上菌落圓形、凸起,瑞氏染色可見兩極濃染,革蘭氏染色呈現(xiàn)陰性菌落,普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱、ss瓊脂平板不生長。
2.2生化試驗結(jié)果
血清平板挑取單個細菌,接種加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基,取適量接種微量生化反應小管,接種后24h~48h觀察結(jié)果,不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖,硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、VP試驗、甲基紅試驗、硫化氫產(chǎn)生、尿素分解陰性,氧化酶、觸酶試驗陽性。(具體結(jié)果見表1)
2.3血清型鑒定結(jié)果
分離的細菌與血清1型的定型血清凝集,與血清2型、血清7型的定型血清不凝集,確定分離的細菌為1型鴨疫里默氏桿菌。
2.4細菌的藥敏試驗結(jié)果
將鴨疫里默氏桿菌的均勻涂布于含10%血清的營養(yǎng)瓊脂平板,將含有相應藥物的藥敏片貼于瓊脂上,37"C溫箱培養(yǎng)36h,可見明顯的抑菌圈,根據(jù)抑菌圈的大小判定分離細菌對藥物的敏感程度,頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、磷霉素、阿莫西林、青霉素高敏,氧氟沙星、恩諾沙星、強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素中敏,林可霉素、壯觀霉素低敏,紅霉素、慶大霉素、鏈霉素不敏感。(具體藥敏結(jié)果見表2)
2.5PCR病毒檢測結(jié)果
病料研磨處理后,PCR檢測最終流感、腺病毒、黃病毒、鴨肝炎病毒全部為陰性,發(fā)病鴨子沒有感染這4種病毒。
2.6細菌16SrRNA檢測結(jié)果
分離的細菌處理后,PcR擴增產(chǎn)物測序,最后進行結(jié)果確定為鴨疫里默氏桿菌。
2.7毒力實驗結(jié)果
分離的1型鴨疫里默氏桿菌,分別按照1X108CFU/ml,5X107CFU/ml,2X107CFU/ml,1X107CFU/ml稀釋劑量進行攻毒,腹腔注射1ml,每組5只,攻毒后觀察7d,其中IX108CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退,第3d、第4d全部死亡,死亡前鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀,解剖可見心臟、肝臟輕度的纖維素滲出;5X107CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退,慢慢開始發(fā)病,第4d、第5d全部死亡,死亡的鴨子有鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀,解剖可見心臟、肝臟的纖維素滲出;2X107CFU/ml攻毒劑量組開始精神沉郁、食欲減退,慢慢開始發(fā)病,第4d、第5d死亡2只,死亡的鴨子有鴨子扭頸、角弓反張、癱瘓等神經(jīng)癥狀,解剖可見心臟、肝臟的嚴重纖維素滲出,另外3只有適當?shù)木癯劣簟⑹秤麥p退,觀察7d見活;1X107CFU/ml攻毒劑量組,,有1只第4d開始精神沉郁、食欲減退,第2d恢復,其他4只觀察7d精神、食欲未見明顯的變化,分離的鴨疫里默氏桿菌對櫻桃谷肉鴨的最小致死量為5X107CFU,最小發(fā)病劑量是2X107CFU,1X107CFU劑量不能引起14日齡的櫻桃谷鴨發(fā)病。對照組5只觀察7d,未見精神食欲有任何變化。(具體藥敏結(jié)果見表3)
3小結(jié)與討論
3.1鴨疫里默氏桿菌屬于環(huán)境致病菌
是鴨養(yǎng)殖過程中的一種常見的疾病,一般的發(fā)病群體是幼鴨,一年四季都可以發(fā)生,發(fā)病的誘因是各種應激因素,飼養(yǎng)密度過大、環(huán)境通風不良、墊草潮濕、飼料品質(zhì)不良、環(huán)境溫度忽高忽低、維生素缺乏等等因素都會造成疾病的發(fā)生,另外一些疾病大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨病毒性肝炎等疾病也會與鴨疫里默氏桿菌的一起發(fā)生,形成繼發(fā)感染。鴨疫里默氏桿菌傳染源主要是污染的飼料、墊草等,可以通過呼吸道、消化道傳播,養(yǎng)殖場發(fā)病一般有明顯的疫點,從一個點爆發(fā),向周邊發(fā)生蔓延。
3.2鴨疫里默氏桿菌的發(fā)病臨床主要癥狀
是神經(jīng)癥狀、角弓反張、癱瘓,解剖癥狀主要是心包炎和肝周炎,在疾病診斷時需要鑒別診斷。其中引起臨床神經(jīng)癥狀的疾病有流感、巴氏桿菌、鴨肝炎、維生素B1缺乏等,引起心包炎肝周炎的疾病有大腸桿菌、沙門氏菌等,僅僅依靠臨床的觀察和解剖很難確診,需要仔細的結(jié)合臨床癥狀、發(fā)病情況區(qū)別診斷,必要時需要進行實驗室的細菌分離和病毒檢測才能確診。一旦發(fā)生疾病,結(jié)合神經(jīng)癥狀和心包炎肝周炎可以初步診斷為鴨疫里默氏桿菌病,進行PCR基因擴增病毒的檢測流感和鴨肝炎檢測可以區(qū)別,細菌性的大腸桿菌和沙門氏菌卻別需要進行細菌的分離,通過細菌分離鑒定可以區(qū)別這幾種細菌。
3.3養(yǎng)殖場一旦發(fā)生疾病
一般開始時癥狀不明顯,容易別忽略,一旦發(fā)生起來,死亡率較高,若不能確診是何種疾病,盲目地投藥更會加重病情。因此一旦發(fā)生疾病,需要及時診斷,必要時需要實驗室的化驗,確診疾病,針對性的治療,進行藥敏試驗,選擇敏感性高的藥物,及時準確地治療疾病,這樣才能控制疾病。對于發(fā)病較多的疫區(qū),可以選擇使用疫苗進行防疫,鴨疫里默氏桿菌有21個血清型,但是國內(nèi)報道的主要發(fā)病血清型是1型、2型和7型,在發(fā)病較多的養(yǎng)殖場可以適當?shù)倪x擇,有必要可以將發(fā)病的鴨子送有資質(zhì)的單位檢測,是否是國內(nèi)常見的發(fā)病血清型。
3.4該病的預防關鍵
是減少應激,不要促進疾病的發(fā)生,可以選擇使用藥物預防,疫苗也是一個不錯的選擇,不同的養(yǎng)殖場可以根據(jù)自己的實際情況,綜合管理,飼料品質(zhì)優(yōu)良,適當添加各種維生素,減少疾病的發(fā)生,減少損失。