黃奧丹 藍增全 吳田

摘要： 以諾麗（Morinda citrifolia）葉片為外植體，在添加不同激素種類和濃度的MS培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，建立兩種離體再生模式：模式Ⅰ為先脫分化愈傷組織，再分化不定根和不定芽；模式Ⅱ為直接培養(yǎng)生根后分化不定芽。結(jié)果表明：在模式Ⅰ中，誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D；誘導(dǎo)葉片愈傷組織再分化出不定根和不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS +1.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA或MS +2.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA，其中MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根時間最早為10 d左右，根系較發(fā)達，而MS + 2.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根時間在15 d左右，根系發(fā)達。在模式Ⅱ中，誘導(dǎo)葉片直接生根長芽的培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA。將模式Ⅰ和模式Ⅱ中，完成諾麗葉片離體再生的苗切下后接種到MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，15 d左右分化出不定根，45 d獲得完整植株。該研究結(jié)果為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化和基因改良研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 諾麗， 植物激素， 愈傷組織， 再生培養(yǎng)

中圖分類號： Q943.1

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06074908

Abstract： Using noni （Morinda citrifolia） leaves as explant for culture in vitro on 3% MS medium with different types and concentrations of plant hormones， two kinds of in vitro regeneration modes were built. Mode Ⅰ： the callus was induced first， and then the adventitious roots and buds were induced； Mode Ⅱ： the adventitious roots were induced， and then the buds were induced directly. The results showed that the optimal medium of generating callus by noni leaves in Mode I was MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D； the optimal medium that induced leaf callus to generate adventitious roots and buds was MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1 NAA or MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA， Thereinto， the solution of MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4mg·L1 NAA made the rooting time earler， about 10 d， and its root system was more developed. Instead， the solution of MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA made it 15 d. The optimal medium that induced leaves to generate roots and buds in mode Ⅱ was MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。Cutting and transplanting the seedlings regenerated in vitro from model Ⅰ and Model Ⅱ into MS + 0.2 mg·L1 NAA medium to induce rooting. Getting the differentiation of adventitious root about 15 d and complete plant 45 d. This study provides useful references for the breeding and the application of genetic transformation technique in noni.

Key words： noni， plant hormones， callus， regeneration of culture

諾麗（Morinda citrifolia）又稱海濱木巴戟、海巴戟天、檄樹（吳田和藍增全，2011；曹艷花，2014），為茜草科（Rubiales）巴戟天屬（Morinda）植物（楊小波2013），是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木。主要生長于溫暖潮濕的熱帶、亞熱帶地區(qū)，在國外主要分布于南太平洋諸島，如大溪地、夏威夷、印度尼西亞等，在我國主要生長于海南島、西沙群島、云南西雙版納及臺灣南部等地區(qū)（何明霞和楊清，2006）?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明， 諾麗果汁中具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用的多糖成分（張學(xué)梅，2000）， 果實單用或與其他植物合用可治療多種疾病，被醫(yī)學(xué)研究者稱為當(dāng)代神奇的治療物質(zhì)（賴茂良，2014）、（段文榮等，2009），有較高的經(jīng)濟價值。

早在2000多年前，波利尼亞人就用諾麗葉片治療疾?。◤垈ッ舻?，2008），以及為服裝染色（白飛榮等，2015）。諾麗鮮葉可以直接咀嚼，或者加水熬汁或浸泡飲用，也可曬干磨成粉末。在巴西諾麗葉被稱為“止痛草”，其對牙齦炎、牙周病、喉痛、感冒、頭疼、骨折、皮膚病等均有一定功效（楊焱等，2009）。吳田和藍增全（2011）以帶腋芽的莖段為外植體對諾麗進行離體培養(yǎng)，建立了高效的離體快速繁殖體系；謝江等（2012）和潘曉晴等（2014）分別以根和不帶腋芽的莖段為外植體，進行諾麗離體再生培養(yǎng)研究；而以諾麗葉片為外植體的離體培養(yǎng)研究還未見報道。無菌培養(yǎng)條件下，諾麗根較細(xì)，諾麗莖段較短，而諾麗葉片較大，作為外植體更容易獲得。因此，本研究以諾麗無菌試管苗葉片為外植體，進行離體再生培養(yǎng)研究，以期為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化及基因改良研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

實驗材料為西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院組培室的諾麗無菌試管苗，取健康、無菌諾麗苗的葉片為外植體。試管苗每90 d左右繼代一次，繼代培養(yǎng)基為MS + 0.2 mg·L1 NAA。

1.2 培養(yǎng)基配制

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6BA、NAA及2，4D，共設(shè)計38種培養(yǎng)基（表1）；再加瓊脂0.6%、蔗糖3%，pH 5.8，分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.3 接種與培養(yǎng)

將諾麗無菌苗葉片，剪去葉尖和葉緣，剪成0.5 cm × 0.5 cm方片，正面向上放于離體再生培養(yǎng)基上，確保其與培養(yǎng)基充分接觸。每瓶培養(yǎng)基中接種5塊葉片，每種培養(yǎng)基接種10瓶。接種后，將材料置于光照強度1 500 lx（12 h·d1）、溫度（28 ± 2）℃的條件培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每5 d觀察1次，統(tǒng)計培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色和生長情況。以上實驗重復(fù)3次。

1.4 離體再生苗生根

將長至2～4 cm的諾麗葉片離體再生苗莖尖切下后，在MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根。觀察生根時間和過程，最終獲得完整植株。

1.5 數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù)；不定根分化率（%）=不定根分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù)；不定芽分化率（%）=不定芽分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù)。

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行計算和方差分析，在方差分析的基礎(chǔ)上，用Duncan法進行多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1 先誘導(dǎo)脫分化愈傷組織，再誘導(dǎo)不定根和不定芽

2.1.1 不同激素組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響由方差分析可知，不同激素組合對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)存在一定影響（表2）。葉片在6BA和2，4D配合使用的培養(yǎng)基上，脫分化能力較好，可在20 d左右形成嫩黃色接近透明的疏松的愈傷組織（圖1： A）。在6BA濃度分別為2.0、3.0 、4.0 mg·L1同時配合使用NAA的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)15 d左右沿葉片主脈出現(xiàn)膨大，并逐漸形成愈傷組織。當(dāng)6BA濃度為2.0 mg·L1，NAA濃度分別為0.1、0.2 、0.3 mg·L1時，葉片能誘導(dǎo)出黃白色顆粒，質(zhì)地疏松的愈傷組織（圖1： B），但愈傷組織脫分化能力一般。當(dāng)6BA濃度為3.0 mg·L1，NAA濃度為0.1、0.2 、0.3 mg·L1時，葉片能誘導(dǎo)出嫩綠色愈傷組織（圖1： C）。當(dāng)NAA濃度高于0.3 mg·L1時， 愈傷組織為黃褐色（圖1： D）。當(dāng)6BA濃度高于4.0 mg·L1時，愈傷組織為黃褐色且脫分化能力弱誘導(dǎo)率低。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至原培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖繼代培養(yǎng)，每20 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，除6BA和2，4D配合使用的培養(yǎng)基，愈傷組織可在繼代培養(yǎng)基中不斷增殖，且愈傷組織質(zhì)地更加疏松呈泥狀，黃色接近透明；其余在6BA和NAA配合使用的培養(yǎng)基上繼代，愈傷組織增殖能力較弱，并逐漸褐化死亡。在6BA濃度為0.1 mg·L1，2，4D濃度為2.0 mg·L1時，愈傷組織脫分化能力最好，誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地松散成泥狀、黃色接近透明，誘導(dǎo)20 d、誘導(dǎo)率高達96.67%，并可不斷增殖繼代培養(yǎng)。因此，誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2，4D。

2.1.2 不同激素組合對諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)影響將諾麗葉片愈傷組織轉(zhuǎn)移至芽或根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表3），發(fā)現(xiàn)單獨使用6BA無任何不定芽或不定根分化，而配合使用了NAA的培養(yǎng)基，在6BA濃度1.0～2.0 mg·L1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而升高；在6BA濃度3.0～4.0 mg·L1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而減低。同時，在6BA濃度1.0 mg·L1，NAA濃度0.4 mg·L1和6BA濃度2.0 mg·L1，NAA濃度0.4mg·L1時芽分化率最高達70.67%（P>0.05差異不顯著）。

通常在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)10～15 d左右，開始分化不定根（圖2： A），而后長出發(fā)達根系（圖2： B）；40 d左右時分化出不定芽（圖2： C）。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA或MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA，兩種培養(yǎng)基之間不定芽分化率差異不顯著（P>0.05），其中MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1

NAA生根時間為10 d左右，根系較發(fā)達；而MS + 2.0 mg·L1 6BA+ 0.1 mg·L1 NAA生根時間在15 d左右，根系發(fā)達。

2.2 直接誘導(dǎo)生根后誘導(dǎo)不定芽

葉片在6BA濃度為1.0～2.0 mg·L1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15 d，不定根沿葉片主脈處分化（圖3： A），隨后長成發(fā)達根系（圖3： B）；培養(yǎng)50 d左右分化出不定芽（圖3： C），最終完成離體再生（圖3： D）。其中6BA濃度1.0 mg·L1、NAA濃度0.4 mg·L1時，芽和根的分化率分別為66.67%和74%。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，離體葉片再生最佳培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。

2.3 離體再生苗生根

將諾麗葉片完成離體再生的苗切下后接種到MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根，10 d左右在切口處形成愈傷組織，15 d后分化出不定根（圖4： A），30 d左右分化出根系（圖4： B），45 d后獲得再生苗完整植株（圖4： C）并分化出發(fā)達根系（圖4： D）。

3討論與結(jié)論

3.1 不同種類激素對葉片分化的影響

本研究以諾麗葉片為外植體， 首次建立了諾麗葉片離體培養(yǎng)體系，并建立兩種不同的再生模式。對于葉片離體再生而言，外植體確定后，影響其再生率的最關(guān)鍵因素為激素。再生培養(yǎng)基中必須同時具有細(xì)胞分裂素類和生長素類物質(zhì)（周瑞金和劉孟軍，2003），在不同生長素和細(xì)胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要（孫俊，2014）。本研究中在MS培養(yǎng)基中單獨添加6BA，葉片不能分化不定根和不定芽，在同時添加6BA和NAA兩種激素后完成了葉片離體培養(yǎng)，說明諾麗葉片離體培養(yǎng)中這兩種激素配合使用效果較好，與大多數(shù)木本植物的研究結(jié)果一致（Chen & Hsia，2006）。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長能力和分化方向不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內(nèi)源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異（黃學(xué)林和李筱菊，1986）。

3.2 不同種類生長素和濃度對葉片離體再生方式的影響

生長素的種類和濃度影響離體葉片分化不定芽的途徑，即是直接由葉片分化不定芽，還是先形成愈傷組織再分化不定芽（丁愛萍和王洪范，1996）。本研究以諾麗葉片為外植體，建立了兩種離體再生模式（模式Ⅰ為先誘導(dǎo)愈傷組織后誘導(dǎo)不定根不定芽；模式Ⅱ為不通過愈傷組織直接誘導(dǎo)不定根后誘導(dǎo)不定芽）。諾麗葉片離體培養(yǎng)過程中，無論是哪種再生模式，愈傷組織、不定芽和不定根都是在主脈處形成，分析其原因，可能是雙子葉植物葉片主脈含有維管束，在維管束的木質(zhì)部和韌皮部之間還存在形成層（李揚漢，1984），形成層細(xì)胞可能具有較強的分生和再生能力（柴慈江等，2011），所以促進了愈傷組織、不定根和不定芽的形成。歐陽超等（2014）的研究發(fā)現(xiàn)，含主脈的葉塊其愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于不含主脈葉塊；Vieitez（1996）等研究指出，清水鋼葉片離體培養(yǎng)中，不定芽的形成主要在葉柄和主脈形成的愈傷組織上分化。本研究中模式Ⅰ和模式Ⅱ的離體培養(yǎng)時間分別為65 d和50 d，兩種模式使用的誘導(dǎo)時間差異主要是由于模式Ⅰ誘導(dǎo)愈傷組織的時間在20 d左右，模式Ⅱ利用諾麗葉片直接再生不定芽體系，未經(jīng)愈傷組織，簡化了操作步驟，縮短了不定芽再生時間。

參考文獻：

BAI FR， LIU Y， CAO YH， et al， 2015. Isolation and identification of endophytes in wild noni leaves from paracel islands [J]. J Food Sci Technol， 33（1）： 32-37. [白飛榮， 劉洋， 曹艷花， 等， 2015. 西沙野生諾麗葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定 [J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報， 33（1）： 32-37.]

CAO YH， LIU Y， YAO S， et al， 2014. Communities diversity of endophytic bacteria from fruit of Morinda citrifolia（noni） [J]. J Food Sci Technol， 32（2）： 39-45. [曹艷花， 劉洋， 姚粟， 等， 2014. 西沙野生諾尼內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性初步研究 [J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報， 32（2）： 39-45.]

CHAI CJ， SUN SH， WANG Y， et al， 2011. Plant regeneration from in vitro cultured leaves of Malus zumi [J]. J Fruit Sci， 28（1）： 124-128. [柴慈江， 孫世海， 王玉， 等， 2011. 珠美海棠葉片離體培養(yǎng)與植株再生 [J]. 果樹學(xué)報， 28（1）： 124-128.]

CHEN UC， HSIA CN， YEH MS， et al， 2006. In vitro micropropagation and ex vitro acclimation of Bupleurum kaoi—an endangered medicinal plant native to Taiwan [J]. In Vitro Cell Dev Biol Plant， （42）： 128-133.

DING AP， WANG HF， 1996. Factors that affect apple in vitro leaves adventitious bud differentiation [J]. Chin Fruits， 4： 20-21. [丁愛萍， 王洪范， 1996. 影響蘋果離體葉片分化不定芽的因素 [J]. 中國果樹， 4： 20-21.]

DUANG WR， CUI JY， YANG Q， et al， 2009. Biological features of Morinda citrifolia and techniques for introduced cultivation [J]. For Inv Plan， 34（1）： 125-128. [段文榮， 崔景云， 楊清， 等， 2009. 海巴戟的生物學(xué)特性及引種栽培技術(shù) [J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃， 34（1）： 125-128.]

HE MX， YANG Q， 2006. The cultivation and development prospects of Morinda citrifolia Linn [J]. Chin Trop Agric， （4）： 28-29. [何明霞， 楊清， 2006. 海巴戟的引種栽培及發(fā)展前景 [J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，（4）： 28-29.]

HUANG XL， LI XJ， 1986. The formation and control of high plant tissue culture in vitro [M]. Beijing： Science Publishing House： 247. [黃學(xué)林， 李筱菊， 1986. 高等植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及調(diào)控 [M]. 北京： 科學(xué)出版社： 247.]

LAI ML， 2014. Morinda citrifolia Linn（noni） study on genetic diversity of genetic diversity of germplasm resources [D]. Hainan University： 3. [賴茂良， 2014. 海巴戟（noni）種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究 [D]. 海南大學(xué)： 3.]

LI YH， 1984. Botany [M]. 2nd ed. Shanghai： Shanghai Science and Technology Publishing House： 146. [李揚漢， 1984. 植物學(xué) [M]. 第2版. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社： 146.]

OU YC， MO TH， ZENG LX， 2014. Callus from bagged seedings leaves of Hevea Brasiliensis müll. Arg. Clone Reyan 7-33-97. [J]. Chin J Trop Crops， 35（6）： 1124-1130. [歐陽超， 莫廷輝， 曾麗星， 2014. 熱研7-33-97袋裝苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究 [J]. 熱帶作物學(xué)報， 35（6）： 1124-1130.]

PAN XQ， WU T， LAN ZQ， et al， 2014. Regeneration of stem segments of noni （Morinda citrifolia Linn.） [J]. J NE For Univ， 42（8）： 20-24. [潘曉晴， 吳田， 藍增全， 等， 2014. 諾麗莖段的離體再生 [J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 42（8）： 20-24.]

SUN J， 2014. The high efficient regeneration system of Pyrus ussuriensis Maxim leaf in vitro culture [J]. Jiangsu Agric Sci， 42（3）： 44-46. [孫俊， 2014. 南果梨葉片離體培養(yǎng)的高效再生體系 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 42（3）： 44-46.]

VIEITEZ AM， SANJOSE MC， 1996. Adventitious shoot regeneration from Fagus sylvatica leaf explants in vitro [J]. In vitro Cell Dev Biol， 32（3）： 140-147.

WU T， LAN ZQ， 2011. Study on culture in vitro of noni （Morinda Citrifolia Linn） [J]. J Shandong Agric Univ（Nat Sci Ed）， 42（2）： 179-182. [吳田， 藍增全， 2011. 諾麗離體培養(yǎng)研究 [J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 42（2）： 179-182.]

XIE J， WU T， ZANG TT， et al， 2012. Callus induction and plant regeneration of Morinda citrifolia Linn [J]. Jiangsu Agric Sci， 40（6）： 47-48，130. [謝江， 吳田， 張婷婷， 等， 2012. 海濱木巴戟愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 40（6）： 47-48，130.]

YANG XB， 2013. Hainan plants [M]. Beijing： Science Publishing House： 340-341. [楊小波， 2013. 海南植物名錄 [M]. 北京： 科學(xué)出版社： 340-341.]

YANG Y， LIU CF， LI HQ， et al， 2009. Recent advances in Morinda citrifolia research and suggestions on its application [J]. Trop Agric Sci & Technol， 32（4）： 23-24. [楊焱， 劉昌芬， 李海泉， 等， 2009. 海巴戟研究進展及開發(fā)應(yīng)用建議 [J].熱帶農(nóng)業(yè)科技， 32（4）： 23-24.]

ZHANG WM， FU WY， FU CX， et al， 2008. Distribution and nutritional evaluation of primary functional components in Morinda citrifolia [J]. Food Sci， 29（10）： 575-577. [張偉敏， 符文英， 符傳賢， 2008.諾麗果實和葉中主要功能性物質(zhì)的分布于營養(yǎng)評價 [J].食品科學(xué)， 29（10）： 575-577.]

ZHANG XM， 2000. Immune regulation of polysaccharide in Morinda citrifolia Linn has the effects of an titumor [J]. Drugs & Clinic， 15（5）： 207-208. [張學(xué)梅， 2000. 海巴戟果汁中具免疫調(diào)節(jié)作用的多糖具抗腫瘤作用 [J]. 國外醫(yī)藥（植物藥分冊）， 15（5）： 207-208.]

ZHOU RJ， LIU MJ， 2003. Advances in regeneration from leaf explants in fruit tree [J]. Biotechnology， 13（6）： 65-66. [周瑞金， 劉孟軍， 2003. 果樹離體葉片培養(yǎng)再生研究進展 [J]. 生物技術(shù)， 13（6）： 65-66.]