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        諾麗葉片的離體再生

        2017-05-30 20:40:03黃奧丹藍增全吳田
        廣西植物 2017年6期
        關(guān)鍵詞:愈傷組織

        黃奧丹 藍增全 吳田

        摘要: 以諾麗(Morinda citrifolia)葉片為外植體,在添加不同激素種類和濃度的MS培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng),建立兩種離體再生模式:模式Ⅰ為先脫分化愈傷組織,再分化不定根和不定芽;模式Ⅱ為直接培養(yǎng)生根后分化不定芽。結(jié)果表明:在模式Ⅰ中,誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2,4D;誘導(dǎo)葉片愈傷組織再分化出不定根和不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS +1.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA或MS +2.0 mg·L16BA+ 0.4 mg·L1 NAA,其中MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根時間最早為10 d左右,根系較發(fā)達,而MS + 2.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA生根時間在15 d左右,根系發(fā)達。在模式Ⅱ中,誘導(dǎo)葉片直接生根長芽的培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L16BA + 0.4 mg·L1 NAA。將模式Ⅰ和模式Ⅱ中,完成諾麗葉片離體再生的苗切下后接種到MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根,15 d左右分化出不定根,45 d獲得完整植株。該研究結(jié)果為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化和基因改良研究奠定了基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞: 諾麗, 植物激素, 愈傷組織, 再生培養(yǎng)

        中圖分類號: Q943.1

        文獻標(biāo)識碼: A

        文章編號: 10003142(2017)06074908

        Abstract: Using noni (Morinda citrifolia) leaves as explant for culture in vitro on 3% MS medium with different types and concentrations of plant hormones, two kinds of in vitro regeneration modes were built. Mode Ⅰ: the callus was induced first, and then the adventitious roots and buds were induced; Mode Ⅱ: the adventitious roots were induced, and then the buds were induced directly. The results showed that the optimal medium of generating callus by noni leaves in Mode I was MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2,4D; the optimal medium that induced leaf callus to generate adventitious roots and buds was MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1 NAA or MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA, Thereinto, the solution of MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4mg·L1 NAA made the rooting time earler, about 10 d, and its root system was more developed. Instead, the solution of MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA made it 15 d. The optimal medium that induced leaves to generate roots and buds in mode Ⅱ was MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。Cutting and transplanting the seedlings regenerated in vitro from model Ⅰ and Model Ⅱ into MS + 0.2 mg·L1 NAA medium to induce rooting. Getting the differentiation of adventitious root about 15 d and complete plant 45 d. This study provides useful references for the breeding and the application of genetic transformation technique in noni.

        Key words: noni, plant hormones, callus, regeneration of culture

        諾麗(Morinda citrifolia)又稱海濱木巴戟、海巴戟天、檄樹(吳田和藍增全,2011;曹艷花,2014),為茜草科(Rubiales)巴戟天屬(Morinda)植物(楊小波2013),是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木。主要生長于溫暖潮濕的熱帶、亞熱帶地區(qū),在國外主要分布于南太平洋諸島,如大溪地、夏威夷、印度尼西亞等,在我國主要生長于海南島、西沙群島、云南西雙版納及臺灣南部等地區(qū)(何明霞和楊清,2006)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明, 諾麗果汁中具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用的多糖成分(張學(xué)梅,2000), 果實單用或與其他植物合用可治療多種疾病,被醫(yī)學(xué)研究者稱為當(dāng)代神奇的治療物質(zhì)(賴茂良,2014)、(段文榮等,2009),有較高的經(jīng)濟價值。

        早在2000多年前,波利尼亞人就用諾麗葉片治療疾?。◤垈ッ舻?,2008),以及為服裝染色(白飛榮等,2015)。諾麗鮮葉可以直接咀嚼,或者加水熬汁或浸泡飲用,也可曬干磨成粉末。在巴西諾麗葉被稱為“止痛草”,其對牙齦炎、牙周病、喉痛、感冒、頭疼、骨折、皮膚病等均有一定功效(楊焱等,2009)。吳田和藍增全(2011)以帶腋芽的莖段為外植體對諾麗進行離體培養(yǎng),建立了高效的離體快速繁殖體系;謝江等(2012)和潘曉晴等(2014)分別以根和不帶腋芽的莖段為外植體,進行諾麗離體再生培養(yǎng)研究;而以諾麗葉片為外植體的離體培養(yǎng)研究還未見報道。無菌培養(yǎng)條件下,諾麗根較細(xì),諾麗莖段較短,而諾麗葉片較大,作為外植體更容易獲得。因此,本研究以諾麗無菌試管苗葉片為外植體,進行離體再生培養(yǎng)研究,以期為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化及基因改良研究奠定基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1 材料

        實驗材料為西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院組培室的諾麗無菌試管苗,取健康、無菌諾麗苗的葉片為外植體。試管苗每90 d左右繼代一次,繼代培養(yǎng)基為MS + 0.2 mg·L1 NAA。

        1.2 培養(yǎng)基配制

        以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6BA、NAA及2,4D,共設(shè)計38種培養(yǎng)基(表1);再加瓊脂0.6%、蔗糖3%,pH 5.8,分裝,121 ℃滅菌20 min。

        1.3 接種與培養(yǎng)

        將諾麗無菌苗葉片,剪去葉尖和葉緣,剪成0.5 cm × 0.5 cm方片,正面向上放于離體再生培養(yǎng)基上,確保其與培養(yǎng)基充分接觸。每瓶培養(yǎng)基中接種5塊葉片,每種培養(yǎng)基接種10瓶。接種后,將材料置于光照強度1 500 lx(12 h·d1)、溫度(28 ± 2)℃的條件培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每5 d觀察1次,統(tǒng)計培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色和生長情況。以上實驗重復(fù)3次。

        1.4 離體再生苗生根

        將長至2~4 cm的諾麗葉片離體再生苗莖尖切下后,在MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根。觀察生根時間和過程,最終獲得完整植株。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù);不定根分化率(%)=不定根分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù);不定芽分化率(%)=不定芽分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù)。

        數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行計算和方差分析,在方差分析的基礎(chǔ)上,用Duncan法進行多重比較分析。

        2結(jié)果與分析

        2.1 先誘導(dǎo)脫分化愈傷組織,再誘導(dǎo)不定根和不定芽

        2.1.1 不同激素組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響由方差分析可知,不同激素組合對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)存在一定影響(表2)。葉片在6BA和2,4D配合使用的培養(yǎng)基上,脫分化能力較好,可在20 d左右形成嫩黃色接近透明的疏松的愈傷組織(圖1: A)。在6BA濃度分別為2.0、3.0 、4.0 mg·L1同時配合使用NAA的培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)15 d左右沿葉片主脈出現(xiàn)膨大,并逐漸形成愈傷組織。當(dāng)6BA濃度為2.0 mg·L1,NAA濃度分別為0.1、0.2 、0.3 mg·L1時,葉片能誘導(dǎo)出黃白色顆粒,質(zhì)地疏松的愈傷組織(圖1: B),但愈傷組織脫分化能力一般。當(dāng)6BA濃度為3.0 mg·L1,NAA濃度為0.1、0.2 、0.3 mg·L1時,葉片能誘導(dǎo)出嫩綠色愈傷組織(圖1: C)。當(dāng)NAA濃度高于0.3 mg·L1時, 愈傷組織為黃褐色(圖1: D)。當(dāng)6BA濃度高于4.0 mg·L1時,愈傷組織為黃褐色且脫分化能力弱誘導(dǎo)率低。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至原培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖繼代培養(yǎng),每20 d更換一次新鮮培養(yǎng)基,除6BA和2,4D配合使用的培養(yǎng)基,愈傷組織可在繼代培養(yǎng)基中不斷增殖,且愈傷組織質(zhì)地更加疏松呈泥狀,黃色接近透明;其余在6BA和NAA配合使用的培養(yǎng)基上繼代,愈傷組織增殖能力較弱,并逐漸褐化死亡。在6BA濃度為0.1 mg·L1,2,4D濃度為2.0 mg·L1時,愈傷組織脫分化能力最好,誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地松散成泥狀、黃色接近透明,誘導(dǎo)20 d、誘導(dǎo)率高達96.67%,并可不斷增殖繼代培養(yǎng)。因此,誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS + 0.1 mg·L1 6BA + 2.0 mg·L1 2,4D。

        2.1.2 不同激素組合對諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)影響將諾麗葉片愈傷組織轉(zhuǎn)移至芽或根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(表3),發(fā)現(xiàn)單獨使用6BA無任何不定芽或不定根分化,而配合使用了NAA的培養(yǎng)基,在6BA濃度1.0~2.0 mg·L1之間,不定根分化率隨NAA濃度的增加而升高;在6BA濃度3.0~4.0 mg·L1之間,不定根分化率隨NAA濃度的增加而減低。同時,在6BA濃度1.0 mg·L1,NAA濃度0.4 mg·L1和6BA濃度2.0 mg·L1,NAA濃度0.4mg·L1時芽分化率最高達70.67%(P>0.05差異不顯著)。

        通常在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)10~15 d左右,開始分化不定根(圖2: A),而后長出發(fā)達根系(圖2: B);40 d左右時分化出不定芽(圖2: C)。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素,諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA或MS + 2.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA,兩種培養(yǎng)基之間不定芽分化率差異不顯著(P>0.05),其中MS + 1.0 mg·L1 6BA+ 0.4 mg·L1

        NAA生根時間為10 d左右,根系較發(fā)達;而MS + 2.0 mg·L1 6BA+ 0.1 mg·L1 NAA生根時間在15 d左右,根系發(fā)達。

        2.2 直接誘導(dǎo)生根后誘導(dǎo)不定芽

        葉片在6BA濃度為1.0~2.0 mg·L1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~15 d,不定根沿葉片主脈處分化(圖3: A),隨后長成發(fā)達根系(圖3: B);培養(yǎng)50 d左右分化出不定芽(圖3: C),最終完成離體再生(圖3: D)。其中6BA濃度1.0 mg·L1、NAA濃度0.4 mg·L1時,芽和根的分化率分別為66.67%和74%。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素,離體葉片再生最佳培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L1 6BA + 0.4 mg·L1 NAA。

        2.3 離體再生苗生根

        將諾麗葉片完成離體再生的苗切下后接種到MS + 0.2 mg·L1 NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根,10 d左右在切口處形成愈傷組織,15 d后分化出不定根(圖4: A),30 d左右分化出根系(圖4: B),45 d后獲得再生苗完整植株(圖4: C)并分化出發(fā)達根系(圖4: D)。

        3討論與結(jié)論

        3.1 不同種類激素對葉片分化的影響

        本研究以諾麗葉片為外植體, 首次建立了諾麗葉片離體培養(yǎng)體系,并建立兩種不同的再生模式。對于葉片離體再生而言,外植體確定后,影響其再生率的最關(guān)鍵因素為激素。再生培養(yǎng)基中必須同時具有細(xì)胞分裂素類和生長素類物質(zhì)(周瑞金和劉孟軍,2003),在不同生長素和細(xì)胞分裂素的配合使用中,兩者的比例十分重要(孫俊,2014)。本研究中在MS培養(yǎng)基中單獨添加6BA,葉片不能分化不定根和不定芽,在同時添加6BA和NAA兩種激素后完成了葉片離體培養(yǎng),說明諾麗葉片離體培養(yǎng)中這兩種激素配合使用效果較好,與大多數(shù)木本植物的研究結(jié)果一致(Chen & Hsia,2006)。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長能力和分化方向不同,可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類,從而影響內(nèi)源激素的分布水平,進而在生長和分化上形成差異(黃學(xué)林和李筱菊,1986)。

        3.2 不同種類生長素和濃度對葉片離體再生方式的影響

        生長素的種類和濃度影響離體葉片分化不定芽的途徑,即是直接由葉片分化不定芽,還是先形成愈傷組織再分化不定芽(丁愛萍和王洪范,1996)。本研究以諾麗葉片為外植體,建立了兩種離體再生模式(模式Ⅰ為先誘導(dǎo)愈傷組織后誘導(dǎo)不定根不定芽;模式Ⅱ為不通過愈傷組織直接誘導(dǎo)不定根后誘導(dǎo)不定芽)。諾麗葉片離體培養(yǎng)過程中,無論是哪種再生模式,愈傷組織、不定芽和不定根都是在主脈處形成,分析其原因,可能是雙子葉植物葉片主脈含有維管束,在維管束的木質(zhì)部和韌皮部之間還存在形成層(李揚漢,1984),形成層細(xì)胞可能具有較強的分生和再生能力(柴慈江等,2011),所以促進了愈傷組織、不定根和不定芽的形成。歐陽超等(2014)的研究發(fā)現(xiàn),含主脈的葉塊其愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于不含主脈葉塊;Vieitez(1996)等研究指出,清水鋼葉片離體培養(yǎng)中,不定芽的形成主要在葉柄和主脈形成的愈傷組織上分化。本研究中模式Ⅰ和模式Ⅱ的離體培養(yǎng)時間分別為65 d和50 d,兩種模式使用的誘導(dǎo)時間差異主要是由于模式Ⅰ誘導(dǎo)愈傷組織的時間在20 d左右,模式Ⅱ利用諾麗葉片直接再生不定芽體系,未經(jīng)愈傷組織,簡化了操作步驟,縮短了不定芽再生時間。

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