何文平 張旭強 楊鵬軍 仇奕之 王新霞 楊寧

摘要： 高山離子芥（Choraspora bungeana）是一種稀有高山冰緣植物，其生活環(huán)境具有低溫、強紫外線等脅迫因子。PLD在膜磷脂降解及磷脂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，但其活性往往受到多種因素的影響。該研究以高山離子芥試管苗為材料，研究了4 ℃、0 ℃和-4 ℃脅迫下，ABA對高山離子芥試管苗葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響。結(jié)果表明：10， 50和100 μmol·L1 脫落酸（ABA）處理高山離子芥后，線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性均較未添加ABA的處理組線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性高，其中以50 μmol·L1 ABA對離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的促進作用最為顯著；外施0.3 mmol·L1 的ABA合成抑制劑鎢酸鈉處理高山離子芥后，線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性較對照組線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性降低；在50 μmol·L1 ABA + 5 mmol·L1 EGTA處理組中，高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性低于未添加EGTA處理組線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性；在0.3 mmol·L1 鎢酸鈉 + 10 mmol·L1 CaCl2處理組中，高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性高于未添加CaCl2處理組線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性。由此推測，低溫脅迫下ABA可能通過Ca2+介導(dǎo)影響高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD的活性。

關(guān)鍵詞： 低溫脅迫， 高山離子芥， 脫落酸， 磷脂酶D， 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

中圖分類號： Q945.78

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）06074207

Abstract： Choraspora bungeana is a kind of rare alpine periglacial plant. The environment that C. bungeana lives in has many stress factors such as low temperature， strong ultraviolet. PLD plays an important role in degradation of membrane phospholipids and signal transduction of phospholipids. But the activity of PLD is affected by many factors usually. In this study， the plantlets of C. bungeana was used as experimental materials to study the effects of abscisic acid （ABA） on the mitochondrial membrane boundPLD activity in the leaves of plantlets of C. bungeana under low temperature （4， 0 and -4 ℃）. The results indicated that when plantlets of C. bungeana was treated by 10， 50 and 100 μmol·L1 ABA， the mitochondrial membrane boundPLD activity was higher than that in the group without ABA. Among these concentrations of ABA， 50 μmol·L1 ABA was more effective to promote the mitochondrial membrane boundPLD activity compared with ABA of other concentrations. Sodium tungstate was an inhibitor of endogenous ABA biosynthesis and EGTA was a chelating agent of Ca2+， both of them had an important role in researching the signal transduction of ABA and Ca2+. When the plantlets of C. bungeana was treated by 0.3 mmol·L1 Sodium tungstate， the mitochondrial membrane boundPLD activity in the leaves of plantlets of C. bungeana was lower than that in the control without sodium tungstate. When the plantlets of C. bungeana was treated by 50 μmol·L1 ABA+ 5 mmol·L1 EGTA， the mitochondrial membrane boundPLD activity in the leaves of plantlets of C. bungeana was lower than that in the group without EGTA. When the plantlets of C. bungeana was treated by 0.3 mmol·L1 sodium tungstate + 10 mmol·L1 CaCl2， the mitochondrial membrane boundPLD activity in the leaves of plantlets of C. bungeana was higher than that in the group without CaCl2. From above results， ABA could affect on the mitochondrial membrane boundPLD activity in the leaves of plantlets of C. bungeana by Ca2+ under low temperature.

Key words： low temperature stress， Choraspora bungeana， abscisic acid （ABA）， phospholipase D， signal transduction

適宜的溫度是植物生長的必要條件，而低溫能對植物的生長產(chǎn)生顯著的脅迫影響。0 ℃以下低溫脅迫和0 ℃以上低溫脅迫均能對農(nóng)作物產(chǎn)生不同程度的低溫凍害和低溫冷害（王向輝，2011）。因此，在植物體中有關(guān)植物抗寒的分子機制和生理功能備受人們的關(guān)注。在植物的細(xì)胞膜中廣泛分布著磷脂，而磷脂對生物膜的活性及機體正常代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用（楊志彪，2008）。植物的抗寒能力與膜磷脂有關(guān)，且生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及功能的完整性直接與植物抗寒機制相聯(lián)系（許英等，2015）。因此，磷脂對于植物的抗寒性來說意義重大。PLD是一類酯鍵水解酶，催化磷脂分子的水解。在植物磷脂降解反應(yīng)中PLD被認(rèn)為是起始酶類。PLD催化磷脂水解的產(chǎn)物之一是磷脂酸（PA），而PA極不穩(wěn)定，一部分易轉(zhuǎn)化為二?；视停―AG）參與下游反應(yīng)，剩余部分又參與膜的重建（Meijer et al，2003）。因此，PLD既參與膜的降解又參與膜的重建，又在植物抗逆性中如低溫、干旱等方面發(fā)揮重要作用（Moreno et al，2010）。PLD酶促反應(yīng)的產(chǎn)物PA是一個重要的第二信使，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，而PLD活性調(diào)節(jié)又與Ca2+等因素有關(guān)，因此PLD是一個很重要的信號酶。脫落酸（ABA）具有的生理功能較廣泛，在植物發(fā)育調(diào)控中占有重要位置（Mundy et al，1990）。ABA對植物發(fā)育事件的調(diào)控主要通過ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來進行（霍妙娟等，2007）。低溫脅迫會造成機體中ABA的積累，在植物中ABA含量與植物抗寒性有關(guān)（張嚴(yán)偉，2013）。此外，ABA與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系密切，在水分脅迫和鹽脅迫中用ABA合成抑制劑處理植物，會對植物抗氧化系統(tǒng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制（Jiang & Zhang，2002；BellAaire，2000）。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，ABA能促進胞內(nèi)Ca2+水平升高，但也會引起胞內(nèi)Ca2+水平下降（Bush，1995），表明ABA對Ca2+信號的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變起一定的調(diào)控作用。Lee（1996）研究表明，外源ABA能使蠶豆細(xì)胞中IP3的濃度在短時間內(nèi)迅速增加，并產(chǎn)生類似于Ca2+震蕩的現(xiàn)象，這可能從另外一個角度說明細(xì)胞產(chǎn)生鈣震蕩現(xiàn)象的原因。

關(guān)于PLD與ABA之間的相互作用已有報道，但這些報道大多是關(guān)于PLD對ABA的作用。例如在植株葉片中反義抑制PLDα1，則減弱了ABA引起的葉片衰老（Fan et al，2004）；Zhang et al（2004）研究表明PLD催化磷脂水解的產(chǎn)物PA能調(diào)節(jié)ABA信號負(fù)調(diào)控因子ABI1；以往的研究還發(fā)現(xiàn)PLD和PA對ABA的調(diào)控可能存在對立和統(tǒng)一的關(guān)系（張群，2009）等。而關(guān)于ABA對PLD作用機制的研究報道較少，很多細(xì)節(jié)問題還需要進一步探討。本研究以高山離子芥試管苗為材料，研究低溫（4 ℃、0 ℃、-4 ℃）脅迫下ABA對PLD的作用，以期為以后研究ABA與PLD之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供部分理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

高山離子芥（Choraspora bungeana）來自于新疆天山烏魯木齊河源區(qū)。將去皮的種子用70%乙醇浸泡，再用0.1%升汞浸泡5～8 min，無菌水沖洗3次，種子直接接種于含有3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，于25 ℃，2 000 lx，12 h光周期條件下培養(yǎng)。待種子萌發(fā)，長至一定高度后，將試管苗接種于培養(yǎng)基（MS + 0.2 mg·L1 6BA + 30 g·L1 蔗糖 + 7.8 g·L1 瓊脂，pH 5.8）中，培養(yǎng)15 d。

ABA的處理：將生長旺盛，長勢良好的高山離子芥試管苗接種于含不同濃度（10、 50、100 μmol·L1 ）ABA的培養(yǎng)基中，每瓶至少接種3株，每處理3個平行。鎢酸鈉的處理：將0.3 mmol·L1 鎢酸鈉混勻于不含ABA的培養(yǎng)基中然后將生長旺盛、長勢良好的高山離子芥試管苗接種于該培養(yǎng)基中。EGTA的處理：5 mmol·L1 EGTA噴施于生長在含有50 μmol·L1 ABA培養(yǎng)基中的高山離子芥試管苗葉片上。CaCl2處理：將10 mmol·L1 CaCl2 + 0.3 mmol·L1 鎢酸鈉混勻于不含ABA的培養(yǎng)基。

以上處理的材料均置于人工培養(yǎng)箱中，分別在4 ℃，0 ℃和-4 ℃中低溫培養(yǎng)6～72 h。

1.2 方法

1.2.1 高山離子芥磷脂酶D的制備磷脂酶D的制備根據(jù)Mao et al（2007）的方法，略作改變。取0.2 g高山離子芥置于預(yù)冷的研缽中研磨，以10 mmol·L1 pH 7.0 的HEPES 為提取緩沖液，研制成10%的勻漿，轉(zhuǎn)入到離心管中于高速臺式離心機（Beckman，型號：Allegram64R）以1 000 ×g（Rotor：F1010）離心15 min去掉碎片。上清液以15 000 ×g（Rotor：F1010）的離心力離心60 min得到線粒體膜蛋白，所得到的這些蛋白融于100 mmol·L1 ，pH 6.5的DMG中，此時的溶液為線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD酶液。

1.2.2 磷脂酶D活性的測定磷脂酶D活性的測定用酶聯(lián)免疫法（Yong et al，1997），在離心管中配200 μL的反應(yīng)體系，其中100 mmol·L1 DMG（pH 6.5），10 mmol·L1 MgCl2，0.1 mmol·L1 CaCl2，5 mmol·L1 亞油酸，20 μL酶液以及12 mmol·L1 PC（最后加入）。反應(yīng)體系于30 ℃水浴中反應(yīng)30 min，然后在沸水浴中反應(yīng)15 min 以終止反應(yīng)。冷卻后加入顯色液800 μL，在30 ℃水浴中反應(yīng)60 min，待色澤穩(wěn)定后加入脫蛋白液，搖勻，用0.22 μL孔徑的濾膜濾去雜蛋白，最后于紫外可見分光光度計（Agilent，型號：G1115A）中在500 nm處測OD值。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0對統(tǒng)一處理隨時間變化的差異性多重比較采用LSD法分析，在Microsoft Excel 2003中作圖。圖片用Power point整合。

2結(jié)果與分析

2.1 不同濃度ABA對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4 ℃、0 ℃和-4 ℃條件下，不同濃度ABA對PLD活性的影響如圖1所示。在4 ℃時，未添加ABA處理（對照組）的高山子芥葉片中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性在0～72 h過程中持續(xù)升高（圖1：A）；而在0 ℃和-4 ℃條件下，PLD活性在0～6 h過程中增加，隨后降低（圖1：B，C）。當(dāng)施加不同濃度ABA處理后，在三個溫度下PLD活性較對照組均普遍升高（圖1：A，B，C），說明各濃度ABA均能促進PLD活性增加。但是不同濃度ABA對PLD活性的促進作用具有差異性：在4 ℃和0 ℃條件下，50 μmol·L1 >100 μmol·L1 >10 μmol·L1 （圖1：A，B）；而在-4 ℃條件下時，則表現(xiàn)出50 μmol·L1 >10 μmol·L1 >100 μmol·L1 （圖1：C）。4 ℃和0 ℃條件下各濃度ABA對PLD活性的促進作用規(guī)律不同于-4 ℃條件下的，推測低溫刺激強度的增加可能改變PLD對ABA的敏感性，其中以50 μmol·L1 ABA對PLD活性的影響最顯著，在4 ℃和-4 ℃條件下，當(dāng)脅迫處理到48 h時PLD活性最大，分別高出對照組111.6%和300.9%；而在0 ℃條件下，當(dāng)脅迫處理到72 h時PLD活性達(dá)到最大值，此時高出對照組623.1%。

2.2 鎢酸鈉對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4 ℃、0 ℃和-4 ℃條件下，用0.3 mmol·L1 鎢酸鈉處理高山離子芥后，其葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的變化如圖2所示。在三個低溫條件下，鎢酸鈉處理組PLD活性較對照組均出現(xiàn)不同程度降低（圖2：A，B，C），且在4 ℃和-4 ℃條件下72 h時，與對照組相比，PLD活性較其他時間點下降最低，分別下降了13.8%和26.9%；在0 ℃條件下48 h時，與對照組相比，PLD活性較其他時間點下降最少，下降了15.9%。說明在低溫脅迫下，鎢酸鈉抑制了PLD活性。其中4 ℃時，鎢酸鈉處理組的PLD活性的變化規(guī)律與對照組非常相似（圖2：A）；而0 ℃和-4 ℃時，鎢酸鈉處理組的PLD活性的無明顯變化規(guī)律（圖2：B，C）。

2.3 ABA和ABA+EGTA處理對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4 ℃、0 ℃和-4 ℃條件下，用50 μmol·L1 ABA + 5 mmol·L1 EGTA處理高山離子芥后其PLD活性的變化如圖3所示。加入EGTA處理后的PLD活性均較未添加EGTA處理的PLD活性低（圖3：A，B，C）；且在4 ℃和0 ℃條件下6 h，與未添加EGTA處理的處理組相比，PLD活性較其他時間點而言下降最少，分別下降了55.7%和20.5%；在-4 ℃條件下72 h時，與未添加EGTA處理的處理組相比，PLD活性較其他時間點而言下降最少，下降了52.1%。表明在低溫條件下EGTA能降低ABA誘導(dǎo)的線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性。

2.4 鎢酸鈉和鎢酸鈉+CaCl2處理對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4 ℃、0 ℃和-4 ℃條件下，用0.3 mmol·L1 鎢酸鈉 + 10 mmol·L1 CaCl2處理高山離子芥后，PLD活性的變化如圖4所示。在0.3 mmol·L1 鎢酸鈉 + 10 mmol·L1 CaCl2處理組中，線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性均較未添加CaCl2處理的處理組表現(xiàn)出不同程度的升高（圖4：A，B，C）；且在4 ℃，0 ℃和-4 ℃條件下，分別在72，48和24 h時，與鎢酸鈉處理組相比，PLD活性較其他時間點而言上升最少，分別高出鎢酸鈉處理組11.2%、35.4%和76.7%。

結(jié)合圖2結(jié)果說明，在低溫脅迫下鎢酸鈉能抑制線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性，而CaCl2的加入能緩解鎢酸鈉對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的抑制效果。

3討論

在植物中PLD是一類磷脂水解酶，不僅能催化磷脂的水解，而且在維持膜結(jié)構(gòu)和功能方面均發(fā)揮著重要的作用（崔德才等，2000）。ABA在植物生長發(fā)育及抗逆性方面具有重要意義，其與細(xì)胞中的信號分子如Ca2+關(guān)系密且（楊洪江，2001）。植物的膜系統(tǒng)一般認(rèn)為是低溫傷害對植物產(chǎn)生作用的最初部位（滕中華等，2001）， PLD在膜的降解及穩(wěn)定性的調(diào)控中起到非常重要的作用，因此關(guān)注PLD活性調(diào)控對于研究植物抗寒性具有重要意義。

ABA作為植物激素中的一種，與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)息息相關(guān)，具有廣泛的生理功能。在本研究中，不同低溫條件下，ABA均能促進PLD活性的增加。鎢酸鈉是一種ABA合成的抑制劑（Hansen & Ggrossmann，2000）。本研究中，當(dāng)用鎢酸鈉處理高山離子芥后降低了其葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性，說明低溫脅迫下ABA參與線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控，ABA合成與否直接影響PLD活性。在低溫下，植物一般會啟動ABA合成系統(tǒng)而合成大量的ABA（劉紅娟等，2008），合成的ABA能引起一系列的生理生化事件來調(diào)控植物氣孔的關(guān)閉。此外植物對激素所作出的反應(yīng)一般認(rèn)為是通過細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度變化來實現(xiàn)的（宋秀芬等，2001）。許濤等（2007）研究表明，乙烯對番茄花柄脫落的誘導(dǎo)作用可被Ca2+螯合劑EGTA所抑制；而ABA對氣孔打開的抑制作用被EGTA所抑制（Suhita et al，2003）；細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)長春花生物堿的合成依賴于Ca2+（ Merillon et al，1991）；進一步的研究表明，Ca2+對ABA信號通路的調(diào)控可能是通過Ca2+依賴于蛋白激酶磷酸化ABA信號通路上的轉(zhuǎn)錄因子如ABF1，ABF4來實現(xiàn)（Zhu et al，2007）。本研究中，在4 ℃， 0 ℃和-4 ℃條件下，用ABA和Ca2+螯合劑EGTA處理高山離子芥后，此時線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性較未添加EGTA處理的處理組低；此外，用鎢酸鈉處理高山離子芥后再用CaCl2處理，則線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性較未添加CaCl2處理的高。說明在低溫脅迫下，ABA對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控與Ca2+有緊密的聯(lián)系。

在低溫脅迫下植物往往會增加細(xì)胞膜的滲透壓（Boudsocq & Lauriere，2005），細(xì)胞膜滲透壓的升高可以引起胞外Ca2+內(nèi)流造成胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的增加（Chinnusamy et al，2004）。而ABA能激活細(xì)胞內(nèi)向鈣離子通道（Gilory & Trewvaas，1994）和質(zhì)膜上非選擇性離子通道（Dang et al，1995）；由此胞外Ca2+能順著濃度梯度進入胞質(zhì)中。此外胞內(nèi)鈣離子還可以通過胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+進入胞質(zhì)從而增加胞質(zhì)中Ca2+的濃度；而在這條途徑中比較典型的是通過第二信使IP3與其特異性受體結(jié)合后，在這過程中ABA可能通過調(diào)控IP3從而促進胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。由此可知，ABA可通過多種途徑來調(diào)控胞內(nèi)Ca2+含量，但在低溫脅迫下ABA具體通過什么途徑來影響細(xì)胞中Ca2+水平從而影響PLD活性，目前仍不清楚，需要進一步的研究。

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