葉江華 吳承禎 賈小麗 陳曉婷 李遠(yuǎn)華 王飛權(quán) 盧莉 鄭茂鐘 胡永樂(lè) 張清旭 王海斌

摘 要 為了分析不同茶樹(shù)對(duì)Pb（鉛）脅迫的響應(yīng)及其組織中不同化學(xué)形態(tài)Pb的累積特性，本研究采用盆栽種植法，探討鐵觀音、肉桂2種茶樹(shù)在不同濃度Pb脅迫下，茶樹(shù)葉片光合生理指標(biāo)，包括光合作用速率和葉綠素含量，以及茶樹(shù)組織Pb含量和不同化學(xué)形態(tài)Pb含量的變化。結(jié)果表明，隨著Pb濃度的增加，茶樹(shù)光合生理指標(biāo)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且與對(duì)照相比，鐵觀音下降的幅度高于肉桂。同一Pb脅迫濃度下，茶樹(shù)組織中Pb含量表現(xiàn)為根>葉。不同化學(xué)形態(tài)Pb含量分析結(jié)果表明，隨著Pb脅迫濃度的升高，2種茶樹(shù)根部可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和殘留態(tài)Pb含量百分比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；2種茶樹(shù)葉片碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、可交換態(tài)Pb、鐵錳氧化態(tài)Pb和有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而殘留態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在Pb脅迫下，不同的茶樹(shù)表現(xiàn)出解毒模式的差異性。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)；Pb脅迫；化學(xué)形態(tài)；光合生理指標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Biological Responses and Pb Speciation in Tissues After

Pb Exposure of Tea Plants

YE Jianghua1，4， WU Chengzhen1， JIA Xiaoli1，3， CHEN Xiaoting2，3， LI Yuanhua4， WANG Feiquan4，

LU Li4， ZHENG Maozhong1， HU Yongle1， ZHANG Qingxu2， WANG Haibin2，3 *

1 Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology（Wuyi University）， Wuyishan， Fujian 354300， China

2 College of Life Sciences， Longyan University， Longyan， Fujian 364012， China

3 Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring， Fujian Agriculture and Forestry

University， Fuzhou， Fujian 350002， China

4 College of tea and food science， Wuyi University， Wuyishan 354300， China

Abstract In order to analyze the physiological responses of different tea trees to Pb stress and accumulation characteristics of Pb with different chemical forms in different tissues of tea trees， photosynthesis rate， chlorophyll content， Pb content in different tissues and Pb content with different chemical forms of Tieguanyin and Rougui tea plants were measured under Pb stess with different concentrations in pot culture. Results showed that the photosynthesis rate and chlorophyll content of tea plants descended with the increase of Pb stress concentration， but the falling range of Tieguanyin was higher than Rougui as compared with the control. At the same concentration of Pb stress， Pb contents in tea plant roots and leaves performed root> leaf. Analysis of Pb contents with different chemical forms showed that the content percentages of exchangeable Pb， carbonate-bound Pb， residual Pb from two tea tree roots had downward trends， while organic-bound Pb and Pb with Fe-Mn oxidation state had upward trends as stress concentration increased. Content percentages of exchangeable Pb， carbonate-bound Pb， organic-bound Pb and Pb with Fe-Mn oxidation state in the leaf appeared to be rising， while residual Pb declined. Further analysis indicated that detoxification patterns of different tea plant varieties exhibited variance under Pb stress.

Key words Tea plant； Pb stress； chemical form； physiological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.005

近年來(lái)，隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用含重金屬元素的農(nóng)藥及肥料，農(nóng)業(yè)灌溉用水重金屬污染等問(wèn)題的日益嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤重金屬污染加劇[1]。茶樹(shù)作為喜酸性植物，長(zhǎng)期種植后土壤的酸化程度不斷增強(qiáng)，重金屬活躍能力提高，有效態(tài)重金屬含量在土壤中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能茶樹(shù)對(duì)重金屬的耐受力有所提升，同時(shí)，也極易導(dǎo)致茶樹(shù)組織增加重金屬積累量，進(jìn)而導(dǎo)致茶葉產(chǎn)品中重金屬含量超標(biāo)，嚴(yán)重?fù)p害了茶葉的經(jīng)濟(jì)效益，降低了茶農(nóng)收入[2-5]。

茶樹(shù)易吸收累積鉛離子，鉛（Pb）主要通過(guò)根系或葉片進(jìn)入植物體，經(jīng)過(guò)大量累積，會(huì)導(dǎo)致植物體中活性氧代謝失調(diào)，嚴(yán)重者還會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[6]。眾多學(xué)者探討了重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，并認(rèn)為高濃度重金屬會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定的毒害作用[7-9]。目前，關(guān)于Pb對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)的影響體現(xiàn)在以下2方面，一方面土壤Pb含量對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)的影響，研究表明茶園土壤中各形態(tài)Pb的含量為硫化物殘?jiān)鼞B(tài)>碳酸鹽結(jié)合態(tài)>吸附態(tài)>有機(jī)結(jié)合態(tài)>交換態(tài)>水溶態(tài)，其中土壤中有效性Pb含量的高低決定了Pb對(duì)茶樹(shù)的毒害能力[10]；另一方面，Pb離子進(jìn)入到茶樹(shù)體內(nèi)后，在茶樹(shù)體內(nèi)分布的形態(tài)、特征、活性、遷移能力等是影響茶樹(shù)生長(zhǎng)的關(guān)鍵[11-12]。

近年來(lái)，茶葉經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提升，含重金屬的農(nóng)藥、化肥、有機(jī)肥等被大量施用，從而保證茶葉的產(chǎn)量，一方面致使茶園土壤中Pb含量增加，另一方面增加茶樹(shù)Pb元素積累量[4-5]。而前人研究主要集中在茶葉加工成品中重金屬的溶出率、重金屬在茶樹(shù)中的累積特性及重金屬對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)的影響等[13-15]，關(guān)于重金屬脅迫后，其離子在茶樹(shù)體內(nèi)的積累及化學(xué)形態(tài)變化未做較深入研究。鑒于此，本研究以鐵觀音、肉桂2種具有代表性的烏龍茶樹(shù)為研究對(duì)象，探討Pb脅迫下，茶樹(shù)光合生理特征變化及其組織中Pb累積特性和化學(xué)形態(tài)變化，以期為研究Pb對(duì)茶樹(shù)的毒害機(jī)理和茶樹(shù)對(duì)Pb的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 Pb脅迫處理30 d后，收集茶樹(shù)根（離根尖2 cm）和倒二葉，用于測(cè)定茶樹(shù)根、葉中Pb含量和不同化學(xué)形態(tài)Pb含量。茶樹(shù)葉片收集后，用自來(lái)水和去離子水洗滌3次，茶樹(shù)根收集后仔細(xì)清除表面附著的土壤，用去離子水洗滌10次，避免根部表面附著金屬離子。

1.1.2 茶樹(shù)種植與不同處理 將未種植過(guò)茶樹(shù)的土壤風(fēng)干并研磨，過(guò)40目篩；土壤的基本理化指標(biāo)為pH5.21、有機(jī)質(zhì)18.43 g/kg、全氮2.05 g/kg、全磷0.43 g/kg、全鉀4.35 g/kg、速效氮124.52 mg/kg、速效磷13.17 mg/kg、速效鉀126.31 mg/kg、Pb 2.13 mg/kg。將土壤裝入盆中，每盆裝土10 kg，選擇長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的1年生鐵觀音、肉桂茶苗，分別移栽到土壤中，每盆種植茶苗5株；茶苗移栽恢復(fù)生長(zhǎng)1個(gè)月后，將茶苗種植土壤適當(dāng)攪動(dòng)使土壤松動(dòng)，將配置好的醋酸鉛溶液緩慢倒入土壤中，盡量使處理液在土壤中分布均勻，每盆添加量2 L，使土壤中的Pb濃度分別達(dá)到50、150、250、350、450 mg/kg，未添加Pb溶液處理的土壤為對(duì)照（定義為0 mg/kg）；處理后，常規(guī)種植茶樹(shù)30 d，每個(gè)處理種植6盆，即6個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 茶苗光合生理指標(biāo)測(cè)定 Pb脅迫處理30 d后，選取不同處理下的茶苗倒二葉（功能葉），采用LI-6400便攜式光合儀測(cè)定茶苗功能葉光合作用速率；采用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定茶苗倒二葉的SPAD值，即葉綠素含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。

1.2.2 茶苗組織Pb含量測(cè)定 參照趙先明等[16]研究的方法，并略作修改。將不同濃度Pb處理下，茶苗的根、葉于80 ℃干燥至恒重，并分別粉碎過(guò)40目篩，待測(cè)。分別稱取上述樣品0.5 g置于150 mL聚四氟乙烯燒杯中，加入25 mL濃硝酸和高氯酸混合液（體積比為5 ∶ 1），蓋上表面皿，浸泡過(guò)夜。次日，160 ℃加熱消解，至消化液呈淡黃色或無(wú)色，體積約為1～2 mL為止。冷卻后，用少量蒸餾水多次洗滌燒杯，合并洗滌液并轉(zhuǎn)入50 mL的容量瓶中，定容，混勻過(guò)濾，待測(cè)，且每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。同時(shí)，以試劑空白為對(duì)照。通過(guò)原子吸收分光光度法進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.2.3 茶苗組織中不同化學(xué)形態(tài)Pb含量測(cè)定

不同濃度Pb處理下，采用化學(xué)試劑逐步提取法提取茶苗組織中不同化學(xué)形態(tài)的Pb[17-18]，所需提取劑及提取順序依次為：80%乙醇，提取可交換態(tài)Pb；去離子水，提取碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb；1 mol/L的氯化鈉溶液，提取有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb；2%醋酸，提取鐵錳氧化態(tài)Pb；0.6 mol/L的鹽酸，提取殘留態(tài)Pb。具體提取方法為：稱取2 g茶苗組織新鮮樣品置于燒杯中，加入25 mL提取劑，浸沒(méi)樣品，置于30 ℃恒溫箱中靜置18 h，回收提取液。繼續(xù)添加等體積的同一提取劑浸提2 h，再次回收提取液，重復(fù)3次，即24 h內(nèi)完成4次提取?；厥盏奶崛∫恨D(zhuǎn)移至燒杯。依照上述方法對(duì)各樣品進(jìn)行不同提取劑的提取，同時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

將不同提取劑獲得的提取液蒸發(fā)至近干，去離子水定容至10 mL，以相應(yīng)提取劑為空白對(duì)照，原子吸收分光光度法測(cè)定樣品中Pb含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Excel、DPS軟件進(jìn)行方差分析、顯著性分析以及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合作用速率、葉綠素含量分析

Pb脅迫下，隨著Pb濃度的增加，茶樹(shù)葉片光合生理相關(guān)指標(biāo)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖1）。與對(duì)照相比，隨著Pb濃度的升高（50～450 mg/kg），鐵觀音茶樹(shù)葉片的光合作用速率、葉綠素含量下降率分別由3.77%上升至32.08%、5.64%上升至47.78%，肉桂茶樹(shù)葉片的光合作用速率、葉綠素含量下降率分別由1.79%上升至19.64%、2.72%上升至39.10%；可見(jiàn)，2種茶樹(shù)葉片的光合作用速率、葉綠素含量響應(yīng)Pb脅迫的敏感性存在一定差異。

2.2 Pb含量分析

不同Pb濃度脅迫下，隨著土壤Pb濃度的增加，茶樹(shù)根、葉的Pb含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且根部Pb含量明顯高于葉部（圖2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著Pb濃度的升高（0～450 mg/kg），鐵觀音茶樹(shù)根部Pb含量由0.53 mg/kg上升至85.87 mg/kg，肉桂則由0.56 mg/kg上升至88.12 mg/kg；葉部Pb含量，鐵觀音由0.27 mg/kg上升至48.14 mg/kg，肉桂由0.29 mg/kg上升至51.38 mg/kg?？梢?jiàn)，不同濃度Pb脅迫下，不同茶樹(shù)根、葉中Pb含量差異較小。

2.3 不同化學(xué)形態(tài)Pb含量分析

由圖3和圖4可知，隨著Pb濃度的增加（0～450 mg/L），2種茶樹(shù)根部可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和殘留態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，鐵觀音分別為9.82%～18.41%、10.21%～23.24%、12.13%～31.45%，肉桂分別為9.35%～16.17%、10.79%～25.21%、11.06%～34.26%；而有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量在2種茶樹(shù)中均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，即鐵觀音分別為19.52%～42.53%和7.38%～25.31%，肉桂分別為16.32%～30.53%和8.04%～38.27%?？梢?jiàn)，Pb脅迫下，隨著土壤Pb脅迫濃度的增加，茶樹(shù)根部有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量不斷上升，而可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和殘留態(tài)Pb則相反；鐵觀音與肉桂2種茶樹(shù)在可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和殘留態(tài)Pb百分含量差異較小，而有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb百分含量上，鐵觀音明顯高于肉桂；鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量則肉桂明顯高于鐵觀音。

由圖3和圖4可知，隨著Pb濃度的增加，鐵觀音和肉桂葉部可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，鐵觀音分別為9.31%～21.23%、5.13%～9.58%、6.87%～15.27%和10.31%～22.65%，肉桂分別為8.83%～15.14%、5.48%～10.23%、7.96%～10.12%和12.46%～19.27%；而殘留態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，鐵觀音為31.27%～68.38%，肉桂則為45.24%～65.27%。分析表明，Pb脅迫下，鐵觀音葉片的可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb百分含量明顯高于肉桂，鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量則低于肉桂。

2.4 生理指標(biāo)及其組織Pb含量的相關(guān)性分析

Pb脅迫下，茶樹(shù)根部指標(biāo)相關(guān)性分析表明（表1），土壤Pb濃度與鐵觀音茶樹(shù)根部Pb、根部可交換態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb、鐵錳氧化態(tài)Pb含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；而土壤Pb濃度與肉桂茶樹(shù)根部Pb含量、根部有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb含量、鐵錳氧化態(tài)Pb含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；此外，2種茶樹(shù)的根部Pb含量均與茶樹(shù)根部可交換態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、鐵錳氧化態(tài)Pb、殘留態(tài)Pb含量呈顯著或極顯著正相關(guān)?？梢?jiàn)，隨著土壤中Pb濃度的增加，茶樹(shù)根部Pb含量呈顯著上升趨勢(shì)，而根部組織中Pb含量變化會(huì)顯著性影響根部組織中不同化學(xué)形態(tài)Pb含量的變化。

茶樹(shù)葉片指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果表明（表2），Pb脅迫下，土壤Pb濃度與兩種茶樹(shù)葉片Pb、葉片可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb、鐵錳氧化態(tài)Pb、殘留態(tài)Pb含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與葉片光合作用速率、葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；兩種茶樹(shù)葉片Pb含量與葉片可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb、鐵錳氧化態(tài)Pb、殘留態(tài)Pb含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與葉片光合作用速率、葉綠素含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。可見(jiàn)，隨著Pb濃度的增加，茶樹(shù)葉片Pb含量及其不同化學(xué)形態(tài)Pb含量均顯著上升，而葉片生理指標(biāo)-光合作用速率、葉綠素含量則顯著下降。

3 討論

Pb是植物的非必需元素，過(guò)量的Pb進(jìn)入植株體內(nèi)，會(huì)引起植物的一系列生理響應(yīng)，如植物吸收過(guò)量的Pb離子，易導(dǎo)致植物光合系統(tǒng)受損，最終影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)[19-20]。本研究中，鐵觀音和肉桂茶樹(shù)葉片光合作用速率、葉綠素含量對(duì)Pb脅迫水平的敏感性有所不同，隨著Pb脅迫水平的升高，2種茶樹(shù)葉片的光合作用速率、葉綠素含量均不斷下降（圖1，表2），與前人有關(guān)研究[21-23]結(jié)果一致；與對(duì)照相比，同一濃度Pb作用下，鐵觀音葉片光合生理相關(guān)指標(biāo)含量下降率明顯高于肉桂（圖1）?？梢?jiàn)，Pb脅迫可能導(dǎo)致茶樹(shù)生理特性變化，而鐵觀音表現(xiàn)出對(duì)Pb脅迫的敏感性優(yōu)于肉桂，肉桂具有更強(qiáng)的重金屬耐受性和適應(yīng)性。

Pb離子通過(guò)根系吸收，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并在不同的部位積累[24]。據(jù)報(bào)道，茶樹(shù)體內(nèi)Pb含量可以明顯高于周?chē)h(huán)境，且體內(nèi)器官組織中Pb的分布率差異明顯[25]。本研究表明，隨著Pb濃度的升高，茶樹(shù)不同組織中Pb含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且Pb含量趨勢(shì)為根>葉，鐵觀音和肉桂同一組織的Pb累積量無(wú)明顯差異（圖2）。可見(jiàn)，不同的茶樹(shù)在Pb吸收和累積等方面存在著一定的相似性。

植物對(duì)金屬離子的耐受性體現(xiàn)為：一方面由于自身對(duì)金屬離子濃度的拮抗作用，減少攝入；另一方面是不同植物對(duì)吸收后的金屬離子的轉(zhuǎn)化及解毒機(jī)制存在差異[26-27]。比如，金屬離子進(jìn)入植物體后，被轉(zhuǎn)化為不同化學(xué)形態(tài)，即植物響應(yīng)金屬離子脅迫的策略表現(xiàn)為不同化學(xué)形態(tài)金屬離子的含量及其所占比例的不同[28]。據(jù)報(bào)道，茶樹(shù)具有吸收并累積鉛的生理特征，那么茶樹(shù)可能存在鉛的特殊解毒機(jī)制[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pb脅迫下，隨著Pb脅迫濃度的增加，茶樹(shù)根部有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb含量百分比不斷上升，而可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和殘留態(tài)Pb則相反；2種茶樹(shù)葉部可交換態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb和鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，殘留態(tài)Pb含量則相反（圖3、圖4）。前人研究表明，可交換態(tài)的金屬是毒害植物、影響其物質(zhì)代謝的關(guān)鍵形態(tài)，碳酸鹽態(tài)金屬離子結(jié)合較弱，容易釋放，容易遷移，以上2種形態(tài)金屬的比率可作為金屬離子植物造成危害的能力的評(píng)價(jià)因子[18]。而有機(jī)結(jié)合態(tài)主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合，極易影響植物代謝過(guò)程中的酶活性及其功能的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)[30]。鐵錳氧化態(tài)和殘留態(tài)可將金屬離子固定形成難溶的化合物，也是植物抵御毒害特有的機(jī)制[31-32]。本研究中，Pb脅迫下，與肉桂相比，鐵觀音葉片光合生理指標(biāo)下降幅度更大，對(duì)Pb脅迫更敏感，可能是由于二者解毒模式的差異，即葉片中不同化學(xué)形態(tài)Pb含量存在差異，鐵觀音葉片的可交換態(tài)Pb、碳酸鹽結(jié)合態(tài)Pb、有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb百分含量明顯高于肉桂，鐵錳氧化態(tài)Pb百分含量則低于肉桂。

綜上所述，本研究以鐵觀音、肉桂為材料，探討不同茶樹(shù)品種對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)及其組織中不同化學(xué)形態(tài)Pb的累積特性，結(jié)果表明，Pb脅迫可降低2種茶樹(shù)的光合作用速率及葉片葉綠素含量，其中鐵觀音的下降幅度高于肉桂；其次，不同茶樹(shù)組織中Pb含量表現(xiàn)為根>葉，且不同的茶樹(shù)品種對(duì)Pb脅迫表現(xiàn)出的解毒模式存在差異，鐵觀音茶樹(shù)根、葉部主要以提高有機(jī)結(jié)合態(tài)Pb降低毒害，而肉桂以提高鐵錳氧化態(tài)Pb降低毒害。關(guān)于不同化學(xué)形態(tài)Pb在植物組織中形成后，如何影響細(xì)胞變化，最終影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，還有待進(jìn)一步研究。

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