金微瑛　童夏生　阮正英

[摘要] 目的 探討大鼠低氧性肺血管重塑時(shí)硫化氫對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在肺血管壁異常堆積的調(diào)節(jié)作用。 方法 購買首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為低氧組（n=14）、低氧+硫氫化鈉（NaHS）組（n=12）、對(duì)照組（n=12），建立大鼠HPH模型，監(jiān)測(cè)其血流動(dòng)力學(xué)，測(cè)定其血漿H2S含量，檢測(cè)其肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，最后進(jìn)行結(jié)果判定與半定量分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05），血漿H2S含量顯著低于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05），肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。低氧組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05）；低氧組、對(duì)照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均逐漸降低（P<0.05）。 結(jié)論 大鼠低氧性肺血管重塑時(shí)硫化氫能夠有效抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表達(dá)，進(jìn)而可能對(duì)低氧性肺血管重塑進(jìn)行有效緩解，值得臨床充分重視。

[關(guān)鍵詞] 大鼠低氧性肺血管重塑；硫化氫；Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白；肺血管壁異常堆積；調(diào)節(jié)作用

[中圖分類號(hào)] R543.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）36-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effects of hydrogen sulfide on abnormal accumulation of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary vascular wall of rats with hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods A total of 38 cases of healthy male Wistar rats purchased from the experimental animal center of Capital Medical University， these rats were divided into hypoxia group （n=14）， hypoxia+sodium hydrosulfide （NaHS） group （n=12） and control group （n=12） according to the random number table method， rat model of HPH was established， hemodynamics was monitored， contents of H2S in plasma were determined， typeⅠand Ⅲ collagen in the lung tissues were detected， finally the results were determined and semi quantitative analyzed and statistically analyzed. Results The mPAP level， RV/（LV+SP） of the hypoxia group were significantly higher（P<0.05）， the content of plasma H2S was significantly lower （P<0.05）， the expression of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary small muscular arteries were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅰ collagen in lung and muscular artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group， control group decreased gradually（P<0.05）， the expressions of type Ⅲ collagen in pulmonary muscular medium artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group were significantly higher than the control group （P<0.05）. The expressions of type Ⅰ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular artery of the hypoxia group were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅲ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular arteries of the hypoxia group， hypoxia group+NaHS group， control group were gradually decreased （P<0.05）. Conclusion Hydrogen sulfide can effectively inhibit the expressions of typeⅠand Ⅲ collagen and mRNA in pulmonary vascular wall， and it may be able to alleviate the pulmonary vascular remodeling of rats， so is worthy of the clinical full attention.

[Key words] Hypoxic pulmonary vascular remodeling of rats； Hydrogen sulfide； Collagen typeⅠand Ⅲ； Abnormal accumulation of pulmonary vascular wall； Regulation

低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）的病理基礎(chǔ)主要為肺血管重塑，而在低氧性肺血管重塑中，膠原重塑占有極為重要的地位，該領(lǐng)域的重要課題就是研究其調(diào)節(jié)機(jī)制[1]。以往臨床普遍認(rèn)為[2]硫化氫（H2S）屬于毒性廢氣，最近臨床發(fā)現(xiàn)[3]，心血管系統(tǒng)會(huì)內(nèi)源性生成H2S，同時(shí)其具有重要的病理生理學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)心肺血管功能的過程中，H2S屬于新型氣體信號(hào)分子，能夠在極大程度上緩解低氧誘導(dǎo)的肺血管重塑及肺動(dòng)脈高壓。本研究探討了大鼠低氧性肺血管重塑時(shí)硫化氫對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在肺血管壁異常堆積的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2016年1～6月購買首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠（批準(zhǔn)號(hào)：091017），體重200～1800 g，平均（190±10）g，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為低氧組（n=14）、低氧+硫氫化鈉（NaHS）組（n=12）、對(duì)照組（n=12）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HPH模型 低氧艙有縫隙相通于外界大氣，能夠?yàn)榕搩?nèi)氣體以較慢的速度進(jìn)出提供良好的前提條件，從而始終保持艙內(nèi)氣壓和大氣壓的平衡。在進(jìn)行低氧處理的過程中在低氧艙內(nèi)放置大鼠，將氮?dú)馔ㄈ肱搩?nèi)，將艙內(nèi)的部分氧氣替換掉，從而有效降低艙內(nèi)氧氣濃度。用小風(fēng)扇不斷混勻艙內(nèi)混合氣體，采用上海雷磁公司生產(chǎn)的RSS-5100型氧濃度監(jiān)測(cè)儀對(duì)艙內(nèi)氧濃度進(jìn)行隨時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)向艙內(nèi)注入的氮?dú)饬髁窟M(jìn)行控制，途徑為對(duì)減壓閥及氣體流量表進(jìn)行調(diào)節(jié)，保持艙內(nèi)氧濃度為（10.0±0.5）%。在常壓低氧艙內(nèi)放置低氧組、低氧+NaHS組大鼠，艙內(nèi)O2、N2分別占10%、90%，每天10：00～16：00連續(xù)低氧6 h，每天1次，共持續(xù)3周。低氧前給予低氧+NaHS組大鼠腹腔注射新鮮配置的14 μmol/kg H2S供體NaHS溶液，每天1次，給予低氧組、對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠具有相同的飲食飲水條件。達(dá)到低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 完成低氧后給予大鼠腹腔注射1.2 g/kg體重烏拉坦麻醉，肺動(dòng)脈、頸動(dòng)脈插管分別對(duì)肺動(dòng)脈平均壓（mPAP）、體循環(huán)平均壓（mAP）進(jìn)行測(cè)定。將胸腔打開，取出心臟，分別對(duì)右心室（RV）、右心室（LV）+右間隔（SP）進(jìn)行稱量，然后計(jì)算RV/（LV+SP）。

1.2.3 血漿H2S含量測(cè)定 將0.5 mL 1%醋酸鋅加入試管中，然后將0.1 mL血漿標(biāo)本加入其中，混勻后將0.5 mL 30 mmol/L三氯化鐵+0.5 mL 20 mmol/L對(duì)苯二胺鹽酸鹽加入其中，在室溫下進(jìn)行20 min的孵育，之后將1 mL 10%三氯醋酸沉淀蛋白加入其中，將2.5 mL蒸餾水加入其中將體積補(bǔ)足至5 mL，離心 5 min，將上清液吸出來，在670 nm處對(duì)上清液的吸光度（A）值進(jìn)行檢測(cè)，然后計(jì)算上清液中H2S含量，在此過程中運(yùn)用亞甲藍(lán)分光光度法，嚴(yán)格依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白檢測(cè) 采用天津TBD公司生產(chǎn)的Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化試劑盒對(duì)肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白進(jìn)行檢測(cè)，采用武漢博士德公司生產(chǎn)的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA原位雜交試劑盒對(duì)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA原位雜交進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 結(jié)果判定與半定量分析方法

陽性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)為光學(xué)顯微鏡下棕黃色顆粒[4]。運(yùn)用半定量積分方法分析肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)強(qiáng)度，隨機(jī)檢測(cè)每張切片中的10條肺小型、中型肌性動(dòng)脈，外徑分別在50 μm以下、50～150 μm之間[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS10.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析（ANOVA），用Bonferroni進(jìn)一步進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）之間的差異均不顯著（P>0.05），三組大鼠的mAP之間的差異均不顯著（P>0.05），見表1。

2.2 三組大鼠的血漿H2S含量比較

低氧組大鼠的血漿H2S含量[（192±22）μmol/L]顯著低于低氧+NaHS組、對(duì)照組[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05），但低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠的H2S含量之間的差異不顯著（P>0.05）。

2.3 三組大鼠肺動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)比較

低氧組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)之間的差異均不顯著（P>0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)之間的差異不顯著（P>0.05），見表2。

2.4 三組大鼠肺動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)比較

低氧組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05），但低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)之間的差異均不顯著（P>0.05）；低氧組、對(duì)照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均逐漸降低（P<0.05），見表3。

3討論

低氧性肺血管重塑一方面包括細(xì)胞外基質(zhì)的改變，另一方面也包括中膜平滑肌細(xì)胞的異常增殖。細(xì)胞外基質(zhì)主要包括兩種成分，一種為彈性蛋白，一種為膠原蛋白[6-8]。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同類型的膠原存在于血管壁中，其中血管壁的抗張力及韌性受Ⅰ型膠原直接而深刻的影響，而其彈性受Ⅲ型膠原直接而深刻的影響。在血管壁中，Ⅰ、Ⅲ型膠原占有極為重要的地位，在對(duì)血管的完整性維持方面發(fā)揮著極為重要的作用[9-13]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[14]，大鼠肺動(dòng)脈羥脯氨酸（代表膠原）含量特異性在HPH形成的情況下提升，進(jìn)而一方面在極大程度上提升Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，另一方面也在極大程度上提升其前膠原mRNA。因此，在低氧性肺血管重塑中，血管壁內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的異常沉積是重要的病理過程。

迄今為止，低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑的形成機(jī)制尚不清楚。氣體信號(hào)分子如一氧化氮與一氧化碳具有快速產(chǎn)生、迅速彌散、作用廣泛等生物學(xué)特性， 它們的發(fā)現(xiàn)將肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制研究帶入了新的階段。以往的研究提示[15-18]，一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。然而低氧性肺血管重塑的形成機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚不明了。在諸多內(nèi)源性生成的氣體分子中，探尋對(duì)心肺血管調(diào)節(jié)具有重要作用的新型氣體信號(hào)分子并揭示其對(duì)肺血管重塑的可能作用機(jī)制是該領(lǐng)域的重大前沿課題。本研究結(jié)果表明，低氧組大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05）；低氧組大鼠的血漿H2S含量[（192±22）μmol/L]顯著低于低氧+NaHS組、對(duì)照組[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05）；低氧組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05）；低氧組、低氧+NaHS組、對(duì)照組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐漸降低（P<0.05），低氧組、低氧+NaHS組大鼠肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；低氧組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)均顯著高于低氧+NaHS組、對(duì)照組（P<0.05）；低氧組、對(duì)照組、低氧+NaHS組大鼠肺小型肌性動(dòng)脈、肺中型肌性動(dòng)脈Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均逐漸降低（P<0.05），與上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。已有研究報(bào)道[19]，內(nèi)源性H2S在體內(nèi)可能有兩種存在形式，一種是氣體H2S形式，另一種則可能以NaHS形式存在。以NaHS形式存在的H2S容易保證溶液中H2S濃度的穩(wěn)定， 文獻(xiàn)報(bào)道H2S的干預(yù)實(shí)驗(yàn)多使用NaHS溶液[20]，因此本實(shí)驗(yàn)中也采用了NaHS溶液來提供H2S。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充NaHS后，大鼠血漿中H2S的含量升高，提示低氧時(shí)體內(nèi)減少了的H2S得到了補(bǔ)充。

總之，大鼠低氧性肺血管重塑時(shí)硫化氫能夠有效抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表達(dá)，進(jìn)而可能對(duì)低氧性肺血管重塑進(jìn)行有效緩解，值得臨床充分重視。

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（收稿日期：2016-09-11）