李權　孫藝涵　蔡業(yè)豐

[摘要] 目的 探討RGS20基因表達與Luminal型乳腺癌臨床病理特征的關系。 方法 利用癌癥基因組圖譜數(shù)據庫（TCGA數(shù)據庫）篩選出1023例乳腺癌病例和98例癌旁對照樣本，收集RGS20基因表達譜資料和臨床信息資料，分析RGS20基因表達與乳腺癌臨床病理特征的相關性及對預后的影響。結果 RGS20基因在不同乳腺癌分子分型中存在明顯的表達差異，其中在Luminal型乳腺癌為低表達，而在三陰性乳腺癌中為高表達。同時在Luminal型乳腺癌中，對RGS20基因表達水平與其臨床病理特征進行分析，發(fā)現(xiàn)RGS20基因表達水平與人種存在相關性（P<0.05），其在黑種人中表達最高。進一步分析發(fā)現(xiàn)RGS20表達水平與ER受體水平存在密切相關（P<0.001），ER受體陽性組其RGS20為低表達。 結論 RGS20基因在Luminal型乳腺癌中表現(xiàn)為低表達，有別于其他類型的乳腺癌，且其表達水平與人種存在相關性，其中可能的機制是ER受體表達導致了RGS20基因的低表達，RGS20基因可能成為Luminal型乳腺癌的一個新的分子標志物。

[關鍵詞] RGS20；乳腺癌；Luminal型乳腺癌；臨床病理特征

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）36-0021-05

[Abstract] Objective To study the relationship between RGS20 gene expression and clinicopathological features of Luminal breast cancer， since the relationship between RGS20 and clinicopathological features of Luminal type breast cancer is not studied so far. Methods RGS20 gene expression and clinical information were collected by screening 1023 cases of breast cancer patients and 98 cases of paracancerous tissue samples in TCGA database. The correlation between RGS20 gene expression and clinicopathological features and prognosis of breast cancer was analyzed. Results The expression levels of RGS20 gene were significantly different in different molecular types of breast cancer， which was low in Luminal type breast cancer and high in triple negative breast cancer. the expression level of RGS20 gene and its clinicopathological features were analyzed in Luminal type breast cancer. The expression level of RGS20 gene was found statistically correlated with human race（P<0.05）， which was the highest among black people. Further analysis showed that RGS20 expression was closely related to ER receptor levels（P<0.001）， and ERGS-positive group had low RGS20 expression. Conclusion RGS20 gene is expressed in Luminal type breast cancer， which is different from other types of breast cancer， and its expression level is related to human race. The possible mechanism is that ER receptor expression leads to low expression of RGS20 gene. Therefore， RGS20 gene may become a new molecular marker of Luminal type breast cancer.

[Key words] RGS20； Breast cancer； Luminal type breast cancer； Clinicopathological features

乳腺癌是一種復雜異質性疾病，在組織學形態(tài)、細胞起源、突變、轉移、疾病分級、治療反應性及臨床表現(xiàn)等方面均有不同[1]?；谌橄侔┻_分子表型，乳腺癌一般被分為3種亞型：Luminal型，Her-2多表達型，三陰性型乳腺癌。Luminal型乳腺癌是指雌激素受體陽性乳腺癌，約占所有乳腺癌的2/3。Lumina乳腺癌往往形態(tài)學上分化較好，與其它類型相比預后較好。

G蛋白信號調節(jié)蛋白（RGS蛋白）是一種Gα亞基GTP酶活性增敏劑，能使GTP酶活性增加100倍，突然中斷G蛋白信號，并對G蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）的生物學特征產生顯著的影響。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRS）家族是一種細胞表面受體，多項證據證明改變GPCRS的表達水平和活性能夠調節(jié)多種細胞功能比如細胞增殖、存活能力、運動性和腫瘤的生長、血管生成和轉移。RGS蛋白和GPCRS的結合具有高度選擇性，產生完全不同的分子作用。RGS蛋白在卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中都有不同程度的表達，并作為一種致癌信號在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，至少有6種RGS蛋白（RGS2、4、10、16、17、19）參加細胞增殖調節(jié)[2-5]。RGS20同屬于RZ/A家族，氨基末端區(qū)富含一串與膜附著有關的半胱氨酸基序，在大腦中高表達，尤其是尾狀核和顳葉。RGS20通常被認為是Gαz選擇性GTP酶激活蛋白，同時也可以與Gαi亞基相互作用從而削弱細胞信號傳遞。RGS20自身并沒有致癌潛能，但是在小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）它通過增加致癌性的Rasgv引導腫瘤病灶形成，調節(jié)細胞聚集，運動性和侵襲能力促進細胞轉移。同時，RGS20在轉移黑色素瘤和轉移乳腺癌中高表達[6-8]。

目前，國內外鮮有RGS20基因和乳腺癌的相關性研究，本研究旨在通過檢測RGS20基因在各類型乳腺癌組織中的表達，并探討RGS20與luminal型乳腺癌的臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據庫分析

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據庫是目前最大的癌癥生物信息數(shù)據庫，包含了大量的生物醫(yī)學信息，我們從中選取乳腺癌患者的RGS20基因表達數(shù)據和臨床數(shù)據，在TCGA數(shù)據庫中篩選得到1023例乳腺癌病例和98例癌旁對照樣本用于分析研究。

按照2011年《St. Gallen》的乳腺癌分子分型指南，對乳腺癌進行分子分型：Luminal 型（ER和/或 PR+）、Her-2陽性型（Her-2過表達、ER 和 PR-）、三陰性型（ER 和 PR-、Her-2-）。根據上述乳腺癌分子分型標準，在TCGA數(shù)據中，篩選出Luminal型乳腺癌共有824例，Her-2陽性型乳腺癌共有38例，三陰性型乳腺癌共有161例。同時，收集入組患者的臨床數(shù)據：性別、年齡、TNM分期、淋巴結轉移等數(shù)據，以及收集RGS20的轉錄組數(shù)據（RPKM），以RGS20基因轉錄組表達數(shù)據的中位數(shù)作為區(qū)分RGS20高低表達的界值，進行后續(xù)統(tǒng)計學分析。

1.2 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件包（IBM SPSS statistics 21.0）進行數(shù)據分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗來判斷其是否符合正態(tài)分布，如果符合正態(tài)分布，則組間比較采用獨立樣本t；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)及率[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 RGS20基因在不同亞型乳腺癌中表達情況

在TCGA數(shù)據庫中，根據乳腺癌分子分型標準，將乳腺癌患者分為Luminal型乳腺癌（ER+/PR+）824例，Her-2陽性型乳腺癌（ER-/PR-，Her-2+）38例和三陰性型乳腺癌（ER-/PR-，Her-2-）161例，分別計算各組的RGS20基因的表達水平。在所有分組中，RGS20基因的表達水平在所有乳腺癌中的表達明顯低于正常組（1023 vs. 98，P=0.002）。RGS20基因在三陰性型乳腺癌中的表達明顯高于正常組織（161 vs. 98，P<0.001），RGS20基因在Luminal型乳腺癌中的表達明顯地低于正常組織（824 vs. 98，P<0.001），然而RGS20基因在Her-2陽性型乳腺癌中的表達與正常組并沒有顯著的統(tǒng)計學差異（38 vs. 98，P=0.512），見圖1。

2.2 RGS20基因與Luminal型乳腺癌的臨床病理特征關聯(lián)性分析

本研究進一步探索RGS20基因與luminal型乳腺癌的臨床病理特征之間的相關性，見表1。結果發(fā)現(xiàn)：RGS20基因表達高低與年齡、TNM臨床分期、病理分期、淋巴結轉移等臨床病例特征之間不存在統(tǒng)計學相關性，但是意外發(fā)現(xiàn)在Luminal型乳腺癌中，RGS20基因的表達與人種存在相關性，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009），在黑種人中表達最高，黃種人次之，白中人最低，見圖2。

2.3 RGS20基因表達與ER受體狀態(tài)的相關性

由于RGS20基因表達水平在Luminal乳腺癌組織、正常乳腺組織、三陰性乳腺癌組織中遞增，由此我們推測RGS20基因表達與ER受體表達程度有關。為了驗證此假設，我們將TCGA數(shù)據庫分成ER陽性組和ER陰性組，分別比較兩組RGS20基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)ER陰性組的乳腺RGS20基因表達水平顯著高于ER陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（808 vs. 215，P<0.001），見圖3。

3討論

2015年中國癌癥年度報道公布了最新的國家癌癥統(tǒng)計數(shù)據，乳腺癌發(fā)病高居女性惡性腫瘤之首。僅乳腺癌新發(fā)人數(shù)就占據新發(fā)女性惡性腫瘤總數(shù)的15%，預計2015新發(fā)乳腺癌達272400人，因乳腺癌死亡人數(shù)達70700人。資料顯示乳腺癌是女性30～59歲年齡組最常見的癌癥，同時乳腺癌是45歲以下女性因癌致死最常見的原因。女性乳腺癌的年齡標準發(fā)生率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，具體升高程度不詳[9]。其中乳腺癌最常見的類型為luminal型乳腺癌，Luminal型又分為Luminal A型（ER+，PR+，Her-2-，ki-67低表達）和Luminal B型（ER+，PR+，Her-2+或ki-67高表達），雖然同屬激素受體陽性，但是臨床特點及對治療反應性和預后有明顯差異[10]。Luminal A是乳腺癌最常見的分子亞型，通常為早期乳腺癌，復發(fā)風險較低，對內分泌治療敏感，化療不敏感，預后最好[11]。與Luminal A相比Luminal B的診斷時年齡更輕，腫塊更大，進展相對較快，腋窩淋巴結轉移率更高，激素受體水平較低，腫瘤組織學分級更高，對內分泌治療敏感性較低，化療較敏感，預后相對較差[12]。相關研究表明Luminal A和Luminal B在五年生存率上并沒有統(tǒng)計學差異，但是Luminal B型乳腺癌在確診后5年內復發(fā)率較高[13]。

到目前為止已經發(fā)現(xiàn)了至少20種RGS蛋白，每種均有含有大約120個氨基酸的保守序列，正是這保守區(qū)使得RGS蛋白能夠負性調節(jié)G蛋白信號[14，15]。RGS蛋白家族參與多種細胞功能的調節(jié)，包括促進腫瘤發(fā)生和進展，增值，分化，對神經遞質反應，跨膜轉運，胚胎發(fā)育等[16]。最近多項的研究表明RGS蛋白不僅僅是Gα亞基GTP酶激活蛋白，在不同細胞中還表現(xiàn)出不同的分子功能。隨著對RGS蛋白家族研究的深入，許多RGS蛋白被證明與腫瘤進展相關。比如，RGS17在肺癌和膀胱癌中通過促進cAMP信號通路和CREB磷酸化維持腫瘤細胞的增殖。RGS19通過與GAIP（Gα-interacting protein）作用蛋白的羧基端的PDZ基序結構耦聯(lián)促進細胞增殖。RGS16具有促進甲基化的作用，可以影響乳腺癌的蛋白表達。RGS4通過阻斷MMP2/9減少細胞浸潤和轉移。已經有一些RGS蛋白被驗證具有調節(jié)細胞遷移的能力，比如RGS1與調節(jié)趨化因子誘導的淋巴細胞轉移有關，RGS3影響鼠類動物B淋巴細胞轉移[4，5，17-19]。此外，針對RGS蛋白的靶向治療藥物的研究也不斷出現(xiàn)[19]。

在此項研究中，通過分析TCGA數(shù)據庫我們發(fā)現(xiàn)Luminal型乳腺癌RGS20基因表達低于正常對照組，RGS20基因在三陰性乳腺癌型中呈現(xiàn)高表達，然而Her-2陽性乳腺癌與正常組之間無統(tǒng)計學差異。三陰性乳腺是一種侵襲性極高，惡性程度高，復發(fā)率高的高危型乳腺癌。三陰性乳腺癌占浸潤性乳腺癌的10%～20%[20]，非裔美國人和非洲女性發(fā)病率較高，可高達50%。亞洲女性發(fā)病率與白人女性發(fā)病率相似，BRCA1突變患者中更多[21]。好發(fā)于相對年輕的婦女，預后通常較差[22]。而Luminal型是乳腺癌最常見的分子亞型，預后想對較好，局部復發(fā)和遠處轉移的機率較低[10]。綜合結果表明RGS20基因在乳腺癌中的高表達可能具有促癌作用，提示是RGS20基因可能是一種致癌基因，提示預后不佳。已有兩項研究發(fā)現(xiàn)RGS20在黑色素瘤和轉移性乳腺癌中轉錄水平顯著提升，暗示RGS20具有促癌作用[8，23]。由此推斷l(xiāng)uminal乳腺癌預后較好可能與RGS20低表達有關。另一個有意思的現(xiàn)象，RGS20基因在三陰性型乳性癌和luminal型乳腺癌中呈相反的表達，可能歸因于在雌激素敏感基因中通過褪黑色抑制RGS20基因表達或者促進RGS20基因降解[24-26]，根據TCGA數(shù)據庫的分析，ER受體水平與RGS20基因表達成負相關，從而解釋了RGS20基因在Luminal型乳腺癌表達比正常乳腺組織低，而三陰性乳腺癌的RGS20基因表達高于正常乳腺組織。此外我們發(fā)現(xiàn)，在Luminal型乳腺癌中不同人種表達存在顯著差異，黑種人RGS2基因高表達。國外有文獻報道在ER陽性乳腺癌人群中，黑人相較于白種人有較差的預后，并且此差距在明確診斷后兩年內最明顯[26，27]。這與本研究結果一致，間接表明RGS20基因高表達在乳腺癌中的促癌作用。綜上所述，此項研究為說明在乳腺癌中RGS20基因可能是一個致癌基因，其在Luminal型乳腺癌中RGS20基因低表達，而三陰性乳腺癌高表達，可能與ER受體的表達有關，同時也說明其對乳腺癌的預后有一定的影響，提示RGS20基因可能作為一種新分子標志物判斷乳腺癌的進展和預后。

目前，RGS20基因作為作為一種致癌基因，促進細胞侵襲和浸潤的機制尚未明確被闡述。早前一項研究提示RGS20基因可能通過多種不同途徑，在轉錄或翻譯水平調控腫瘤轉移浸潤。一方面RGS20基因促進上皮-間充質轉變從而進一步促進細胞間連接的分解，下調鈣粘連蛋白上調波形蛋白增加細胞運動性和侵襲性。一方面和RGS17基因相似的是，RGS20基因很有可能間接地通過活化cAMP/PKA通路調節(jié)細胞聚集和轉移。另一方面，RGS20 基因參加一些Gi/z偶聯(lián)受體如褪黑素，MT1， 阿片μ受體，toll樣受體等的信號轉導影響細胞浸潤轉移[26]。

本研究結果提示在Luminal型乳腺癌中低表達，而RGS20基因在三陰性乳腺癌中高表達，由此推測Luminal型乳腺癌的良好預后可能與RGS20基因低表達密切相關。此外RGS20基因高表達與ER受體低表達，在luminal型乳腺癌中，其表達與人種存在相關性，說明RGS20基因可能是Luminal型乳腺癌的一個新分子標志物。

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（收稿日期：2016-06-12）