趙方方++謝德芳++呂岱竹++張?jiān)?+林靖凌++吳瓊

摘要：對(duì)吡唑醚菌酯在香蕉中的低溫貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，同時(shí)建立了吡唑醚菌酯在香蕉中的殘留分析方法。結(jié)果表明，在0.01～0.10 mg/kg添加范圍內(nèi)，吡唑醚菌酯在香蕉中的平均回收率為82%～97%，變異系數(shù)為1.3%～2.7%；方法最小檢出量為1×10-10 g，最低檢出濃度為0.01 mg/kg。通過樣品添加和-20 ℃下低溫貯藏的方法，設(shè)定采樣間隔分別為0、1、3、6及12個(gè)月。取樣檢測(cè)顯示，吡唑醚菌酯的含量沒有明顯變化，說明該農(nóng)藥在-20 ℃下的香蕉樣品中至少貯藏12個(gè)月是穩(wěn)定的。

關(guān)鍵詞：吡唑醚菌酯；香蕉；低溫貯藏穩(wěn)定性；液相色譜

中圖分類號(hào)：X836 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1537-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.033

Study on the Low Temperature Storage Stability of Pyraclostrobine in Banana

ZHAO Fang-fanga，b，XIE De-fanga，b，LV Dai-zhua，b，ZHANG Yuea，b，LIN Jing-linga，b，WU Qionga，b

（a.Analysis&Testing Center；b.Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China）

Abstract： The low temperature storage stability of pyraclostrobine in banana was studied，and the method for the determination of pyraclostrobine residues in banana was established. Average recoveries of pyraclostrobine in banana were found in the range of 82%～97% at the three spiking levels from 0.01 to 0.10 mg/kg with relative standard deviations of 1.3%～2.7%. The lowest detection limit of instrument for pyraclostrobine was 1×10-10 g，and the limit of quantitation was 0.01 mg/kg. The content of pyraclostrobine was not significantly changed by sample addition and -20 ℃ at low temperature. The sampling interval was 0，1， 3，6 and 12 months. It was showed that the pesticide was stable at least 12 months in the banana samples at -20 ℃.

Key words： pyraclostrobine；banana；low temperature storage stability；HPLC

在農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)研究中，樣品在分析前會(huì)被貯藏一段時(shí)間，貯藏條件下的農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性對(duì)農(nóng)藥殘留分析工作者非常重要，同時(shí)它也是農(nóng)藥登記試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重要組成部分[1]。目前農(nóng)業(yè)部擬發(fā)行農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)則，準(zhǔn)則中明確規(guī)定，農(nóng)藥殘留登記試驗(yàn)需要單獨(dú)提交樣品貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)報(bào)告。

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，很多農(nóng)藥都由于種種原因發(fā)生降解，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的假陽性。但是通常情況下根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷貯藏不會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，研究農(nóng)藥低溫貯藏穩(wěn)定性以確保農(nóng)藥殘留分析結(jié)果在一段貯藏時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)有效性，對(duì)于農(nóng)藥殘留分析工作者是非常必要的[2]。

目前，關(guān)于吡唑醚菌酯農(nóng)藥殘留在香蕉中的貯藏穩(wěn)定性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobine）是由德國(guó)巴斯夫公司于1993年開發(fā)的兼具吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[3]，可有效防治多種由真菌病原引起的病害如葉枯病、銹病、白粉病、霜霉病等[4]?，F(xiàn)已在中國(guó)廣泛應(yīng)用于谷物、蔬菜、水果等作物的病害防治上[5-7]。其中，吡唑醚菌酯在防治香蕉黑星病和葉斑病等病害中發(fā)揮了積極作用[8]。目前共有巴斯夫歐洲公司、上海綠澤生物科技有限責(zé)任公司等多家公司進(jìn)行原藥、懸浮劑、乳油、水分散粒劑等51個(gè)產(chǎn)品登記。吡唑醚菌酯的檢測(cè)方法主要采用氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及表面等離子體共振生物傳感技術(shù)等[9-14]。

本研究對(duì)吡唑醚菌酯在香蕉蕉肉樣品中的農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了試驗(yàn)研究。首先建立了吡唑醚菌酯在香蕉果全蕉、蕉肉中的殘留分析方法，方法的靈敏度、精密度和回收率等方面均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。通過樣品添加和-20 ℃下低溫貯藏的方法，并且設(shè)定采樣頻率和間隔時(shí)間，在不同間隔時(shí)間內(nèi)（0、1、3、6及12個(gè)月）進(jìn)行取樣檢測(cè)，為農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)在一段貯藏時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)有效性提供了數(shù)據(jù)支撐，也為分析工作者對(duì)吡唑醚菌酯分析前的貯藏過程提供了一些有意義的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備 Waters高效液相色譜儀（2489紫外檢測(cè)器）；T18高速均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA集團(tuán)）；微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Strata/NH2固相萃取柱（55 μm，70 A）500 mg/6 mL；Carbon/NH2固相萃取柱（55 μm，70 A）500 mg/6 mL；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；萬分之一天平（SHIMAZU）。

1.1.2 被測(cè)物質(zhì) 吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Eh-renstorfer GmbH 公司，純度99.0%）；準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，0～4 ℃保存，按需稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.1.3 化學(xué)試劑 甲醇、乙腈、正己烷、丙酮（色譜純）。

1.1.4 被測(cè)農(nóng)產(chǎn)品 香蕉品種為巴西蕉。香蕉樣本的采集：隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)6～12個(gè)采樣點(diǎn)采集2 kg生長(zhǎng)正常、無病害、成熟的香蕉空白果實(shí)，切段、混勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽。香蕉樣品的制備與保存：田間樣本去凈表面雜質(zhì)，剪去果柄，用刀具縱向?qū)⑾憬肚蟹殖蓛砂辏蒙鬃尤〕鼋度夥湃霌v碎機(jī)，勻漿混勻用四分法縮分，分取250 g樣品兩份，分別裝入樣品容器中，貼好實(shí)驗(yàn)室樣品標(biāo)簽。田間樣本在采集后，8 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并立即制備成實(shí)驗(yàn)室樣品冷凍保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 穩(wěn)定性試驗(yàn)需設(shè)定質(zhì)控樣品，應(yīng)保證每次取樣有空白樣品1個(gè)、質(zhì)控樣品1個(gè)、貯藏添加樣品2個(gè)重復(fù)。樣品中農(nóng)藥的添加水平應(yīng)為分析方法定量限的10倍。取樣檢測(cè)間隔設(shè)定為0、1、3、6及12個(gè)月，共貯藏1年時(shí)間，每次取出2個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)擬發(fā)行的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)則，樣品只做可食部分樣品基質(zhì)，本研究選擇香蕉肉樣品進(jìn)行研究。

1.2.2 空白樣品添加方法 稱取20.0 g粉碎勻漿過的樣品，置于150 mL塑料瓶中，使用0.2 mL移液管吸取0.2 mL 10 μg/mL的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，均勻滴加到香蕉樣品表面，靜置30 min使溶劑緩慢揮發(fā)，用玻璃棒將樣品與殘留農(nóng)藥混合均勻，將塑料瓶用密封蓋密封，置于-20 ℃下冷凍貯藏且在黑暗中保存待測(cè)（添加后的樣品濃度為0.1 mg/kg）。測(cè)樣同時(shí)做空白對(duì)照及質(zhì)控試驗(yàn)（質(zhì)控樣品濃度同添加濃度）。

1.2.3 樣品前處理 1）提取。香蕉樣品：稱取20.0 g粉碎的樣品，置于燒杯中，加入40.0 mL乙腈，2 000 r/min高速勻漿2 min后過濾到預(yù)裝有5～7 g NaCl的具塞量筒（100 mL）中，蓋上塞子，劇烈振蕩2 min后室溫下靜置30 min。吸取上清液10.0 mL至100 mL圓底燒瓶中于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，加入5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）溶解混勻，待凈化。

2）凈化。吸取5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）溶液預(yù)淋洗Strata/NH2固相萃取小柱，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入待凈化液，用100 mL圓底燒瓶收集；用5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）沖洗圓底燒瓶殘留物后淋洗萃取小柱，重復(fù)3次。收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2.5 mL甲醇定容后過0.22 μm濾膜待測(cè)。

1.2.4 液相色譜條件 液相色譜柱：SunfireTM C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速：1 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-水。梯度洗脫步驟見表1。

1.2.5 準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定 量取一定體積的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液加入香蕉蕉肉空白樣品中，制得對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.10 mg/kg的3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平5次試驗(yàn)，同時(shí)做空白對(duì)照，按“1.2.3”進(jìn)行樣品前處理，按“1.2.4”條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取檢測(cè)條件的選擇

吡唑醚菌酯是一種極性農(nóng)藥，20 ℃下，在二氯甲烷中溶解度≥57 g/100 mL，丙酮≥65 g/100 mL，乙腈≥50 g/100 mL；但由于二氯甲烷沸點(diǎn)較低，對(duì)環(huán)境和試驗(yàn)人員污染較大；丙酮毒性低，但其共萃物較多；因此，選擇乙腈作為提取溶劑。吡唑醚菌酯在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm時(shí)響應(yīng)值最大，0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰明顯，S/N>3。

吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品、香蕉空白樣品、質(zhì)控樣品以及貯藏添加樣品（0個(gè)月和12個(gè)月）的液相色譜圖見圖1。樣品先以V（乙腈）∶V（水）=65∶35為流動(dòng)相運(yùn)行9 min，再調(diào)整其體積比為90∶10進(jìn)行測(cè)定，吡唑醚菌酯在香蕉樣品中與雜質(zhì)得到了良好的分離；由圖1可知，吡唑醚菌酯保留時(shí)間為7.237 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

用甲醇做溶劑，逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別配成0.010、0.025、0.050、0.100、0.500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法峰面積定量。以吡唑醚菌酯濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=40 393x+89.712，相關(guān)系數(shù)為0.999 9（圖2）。

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度

香蕉樣品中添加吡唑醚菌酯的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果見表2。由表2可知，3個(gè)添加水平在香蕉中平均回收率為82%～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～2.7%?；厥章室约跋鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則允許范圍內(nèi)[15]，方法的準(zhǔn)確度和精確度可滿足吡唑醚菌酯殘留檢測(cè)的要求。

2.4 最低檢出量與方法定量限

以一定量的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以3倍信噪比所需的待測(cè)物濃度計(jì)算（進(jìn)樣量10 μL），吡唑醚菌酯最小檢出量為1×10-10 g。在香蕉空白樣品中添加一定量的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按10倍信噪比所需的待測(cè)物濃度計(jì)算（以mg/kg為單位），方法定量限為0.01 mg/kg，完全滿足香蕉中吡唑醚菌酯農(nóng)藥殘留限量的檢測(cè)要求（GB 2763-2014中規(guī)定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允許殘留限量為0.02 mg/kg）。

2.5 低溫貯藏試驗(yàn)結(jié)果

香蕉果肉的低溫貯藏試驗(yàn)結(jié)果見表3，每個(gè)樣品重復(fù)2次。由表3可知，對(duì)于貯藏在-20 ℃下的吡唑醚菌酯香蕉樣品，隨著貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)農(nóng)藥有效成分含量稍有差異但并沒有明顯減少。這可能是由于-20 ℃的貯藏溫度相當(dāng)?shù)?，樣品中的微生物活?dòng)能力大大被限制，導(dǎo)致吡唑醚菌酯未被降解；其中不同間隔時(shí)間測(cè)得的農(nóng)藥含量的微小差異很可能是由于農(nóng)藥自身的物化性質(zhì)以及每次前處理試驗(yàn)中試驗(yàn)試劑批次不同、儀器狀態(tài)稍有差異、人為操作等不可避免的因素造成的。

3 結(jié)論

建立了吡唑醚菌酯在香蕉中的殘留分析方法，方法的靈敏度、精密度和回收率等方面均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。通過樣品添加和-20 ℃下低溫貯藏的方法，設(shè)定采樣頻率和間隔時(shí)間，在不同間隔時(shí)間內(nèi)（0、1、3、6及12個(gè)月）進(jìn)行取樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，吡唑醚菌酯在香蕉蕉肉樣品中非常穩(wěn)定，農(nóng)藥含量沒有明顯變化，說明該農(nóng)藥在-20 ℃下的香蕉蕉肉樣品中至少貯藏12個(gè)月是穩(wěn)定的。

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