趙夢(mèng)杰　龔小紅　黨玨　袁岸　李燕　羅林　劉美辰　李蕓霞

[摘要] 為研究48 h的炮制時(shí)間對(duì)何首烏中成分的含量及變化影響。采用HPLC測(cè)定22個(gè)不同炮制時(shí)間的何首烏對(duì)比市售制首烏中各成分的含量，并采用指紋圖譜相似性分析和聚類分析對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行特征分析。結(jié)果顯示，相似度均在0.9～1.0，各個(gè)樣本之間有較好的相關(guān)性。聚類分析方法將22個(gè)制首烏和生首烏樣品基本按成分變化特征聚為4類。該研究發(fā)現(xiàn)4～5 h為何首烏最佳炮制時(shí)間，為何首烏的質(zhì)量控制以及深入研究提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 何首烏； 炮制時(shí)間； 相似性分析； 聚類分析

Effect of processing time of Polygoni Multiflori Radix on

content changes of 16 componens

ZHAO Mengjie， GONG Xiaohong， DANG Jue， YUAN An， LI Yan， LOU Lin， LIU Meichen， LI Yunxia*

（The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine， State Key Laboratory

Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Cofounded by Sichuan

Province and Ministry of Science and Technology of the People′s Republic of China Pharmacy College，

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] To study 48 h processing time of Polygoni Multiflori Radix on its contents and changes of chemical components. HPLC was used to determine the contents of various components in 22 Polygoni Multiflori Radix samples with different processing time， and then the fingerprint similarity analysis and clustering analysis were used for characteristics analysis. Results showed that the similarity was between 0.91.0， with good correlation between the samples. In the clustering analysis， the 22 Polygoni Multiflori Radix and processed Polygoni Multiflori Radix samples were classified into 4 types according to the composition changes. The results demonstrated that 45 h was the best processing time， providing references for quality control and further study of Polygoni Multiflori Radix.

[Key words] Polygoni Multiflori Radix； processing time； similarity analysis； clustering analysis

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，制首烏為何首烏炮制品，性微溫，味甘、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂等功效，臨床常用于治療肝腎不足、精血虧虛、須發(fā)早白等[1]。近年來(lái)何首烏致肝損傷報(bào)道快速增長(zhǎng)[23]，引起國(guó)內(nèi)外的高度關(guān)注。古代強(qiáng)調(diào)何首烏“制非九次，勿寢其毒”，作為典型的生熟異治中藥[4]，何首烏臨床效用的安全發(fā)揮很大程度上受制于其炮制工藝的規(guī)范性與可靠性[5]。何首烏古代炮制強(qiáng)調(diào)九蒸九曝，而現(xiàn)代工藝已化簡(jiǎn)為僅蒸1次，這其中的差異環(huán)節(jié)是否為何首烏肝損傷事件增多的潛在原因？本文為建立和完善制何首烏質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，全面考察了不同炮制時(shí)間的何首烏中二苯乙烯苷類、游離蒽醌、結(jié)合蒽醌、以及其他主要成分的含量及其變化規(guī)律從而為確定何首烏合適的炮制時(shí)間提供參考，并期待建立何首烏炮制減毒工藝規(guī)范提供研究依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀器（泵G1312B，DEACB07224；進(jìn)樣器G1329B，DEAAC25245；柱溫箱G1316A，DEACN27098；紫外檢測(cè)器G4212BDEAA307363 美國(guó)Agilent公司）；KQ500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius 11D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥與試劑

沒(méi)食子酸（批號(hào)150226），原花青素B1（批號(hào)140628），兒茶素（批號(hào)141224），沒(méi)食子酸酯（批號(hào)140730），蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷（批號(hào)141225），虎杖苷（批號(hào)141228），2，3，5，4二苯乙烯苷（批號(hào)141121），土大黃苷（批號(hào)141209），白藜蘆醇（批號(hào)150122），大黃素8OβD葡萄糖苷（批號(hào)141209），大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷（批號(hào)150120），大黃酚（批號(hào)140325），純度>98%，均購(gòu)置于成都克洛瑪生物有限公司。蘆薈大黃素（批號(hào)MUST10112301），大黃酸（批號(hào)MUST11032801），大黃素（批號(hào)MUST12022715），大黃素甲醚（批號(hào)MUST12022005），純度>98%，均購(gòu)置于曼斯特生物科技有限公司。無(wú)水乙醇（批號(hào)20140928）購(gòu)置于成都科龍化工有限公司。甲酸、乙腈均為色譜級(jí)，購(gòu)于Fisher公司。其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

生何首烏藥材購(gòu)置四川省巴中市藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)研究室裴瑾教授鑒定為蓼科植物何首烏P. multiflorum的干燥塊根。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

按《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定，稱取黑豆1.0 kg，10倍量水浸泡30 h后，加水煮約4 h，過(guò)濾，濾渣加8倍量水煎煮3 h后過(guò)濾，合并濾液，濃縮成約2.50 kg。

何首烏黑豆汁4∶1，取一定量大小相近的何首烏塊，先用黑豆汁拌勻，隔水加熱蒸制，分別于1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，14，16，18，20，24，28，32，34，36，40，44，48 h分別取出適量何首烏塊，晾曬至干，平行3份。各時(shí)間點(diǎn)炮制品以及同仁堂售制首烏分別打成粗粉備用。

精密稱取各粗粉0.25 g，置具塞三角瓶中，加20倍量50%乙醇，浸泡30 min后，40 ℃下超聲提取60 min，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品沒(méi)食子酸、原花青素B1，兒茶素、沒(méi)食子酸酯、蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黃苷、白藜蘆醇、大黃素8OβD萄糖苷、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度分別為131，98，185，142，78，125，5 400，142，94，750，86，71，81，500，25，88 μg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃低溫保存。

2.3 色譜條件

ZORBAX C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），ZORBAX C18預(yù)柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL； 流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，5%～10% B；5～30 min，10%～22% B；30～38 min，22%～25% B；38～48 min，25%～32% B；48～55 min，32%～45% B；55～65 min，40%～85% B；65～70 min，85%～95% B；70～72 min，95% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件2004年A版進(jìn)行各個(gè)炮制時(shí)間樣品的相似度分析；采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各個(gè)炮制時(shí)間樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 何首烏各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取何首烏16個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，將對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度稀釋，得到一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3項(xiàng)下的液相條件對(duì)各成分的峰面積進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度平行進(jìn)樣3次，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.1.2 精密度 精密吸取沒(méi)食子酸、原花青素B1，兒茶素、沒(méi)食子酸酯、蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黃苷、白藜蘆醇、大黃素8OβD萄糖苷、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。考察各成分的日內(nèi)精密度以及連續(xù)3 d的日間精密度，計(jì)算各成分的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，各成分的日內(nèi)以及日間精密度RSD均小于6.0%，儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性、穩(wěn)定性以及回收率 取同一批生何首烏藥材，按照2.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備進(jìn)樣，進(jìn)行重復(fù)性考察，各成分的RSD結(jié)果見(jiàn)表3；分別在0，3，6，9，12，24 h進(jìn)樣，考察樣品穩(wěn)定性，計(jì)算各成分的RSD結(jié)果見(jiàn)表3；取已知含量的樣品，加入已知濃度的對(duì)照品適量，采用A=（A樣+標(biāo)-A樣）/ A標(biāo)×100%計(jì)算公式計(jì)算各成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，何首烏各成分，RSD均小于5%，回收率值均在93.99%～107.7%，表明在該分析方法條件下各成分的重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，同時(shí)具有較好的回收率。

3.2 何首烏炮制前后成分的變化

取2.1項(xiàng)下的生何首烏以及21個(gè)不同炮制時(shí)

間的制首烏樣品進(jìn)行含量測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，得到16種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3 構(gòu)建對(duì)照指紋圖譜

采用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版（2004年A版）對(duì)22個(gè)不同炮制時(shí)間的何首烏樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為 0.2 min，獲得對(duì)照?qǐng)D譜R和22個(gè)不同時(shí)間樣本的色譜疊加圖，見(jiàn)圖1，計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)報(bào)告結(jié)果見(jiàn)表5。

通過(guò)中藥指紋圖譜的評(píng)價(jià)系統(tǒng)建立起來(lái)的對(duì)照指紋圖譜與樣品指紋圖譜整體性（保留時(shí)間和峰面積）進(jìn)行相似性比較，相似度一般在≥0.9認(rèn)為符合要求。各炮制時(shí)間樣本在一定的保留時(shí)間誤差范圍內(nèi)（0.2 min）的都能與生成的對(duì)照指紋圖譜有較好的重疊，各炮制時(shí)間的何首烏有較好的相似度。

3.4 聚類分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以中心質(zhì)位數(shù)為組群合并準(zhǔn)則，平方歐氏距離為度量，聚類結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示何首烏不同炮制時(shí)間的樣本共聚分為4類。

從圖2看出，通過(guò)何首烏16種成分的聚類分析，基本反映不同炮制時(shí)間的何首烏成分變化特征。炮制時(shí)間為14，16，18，20，24，28 h的樣本烏很好地聚為第一類；炮制時(shí)間為32，36，40，44，48 h的樣本聚為第二類；炮制時(shí)間為4，5 h的樣本聚為第三類；炮制1，2，3，6，7，8，10，12 h的樣本聚為4類。結(jié)合何首烏成分含量分析，隨著炮制時(shí)間的變化何首烏成分變化呈先增加后降低，隨后趨于穩(wěn)定的的變化趨勢(shì)，炮制到4～5 h何首烏成分的含量達(dá)到最高值，隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)，成分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，炮制到12 h后成分變化趨于穩(wěn)定。

4 討論

炮制時(shí)間的長(zhǎng)短與何首烏的顏色有密切關(guān)系，炮制時(shí)間越長(zhǎng)，顏色逐漸烏黑發(fā)亮，與相關(guān)報(bào)道一致[6]，其飲片外觀和粉末顏色基本一致，表明炮制后飲片內(nèi)外質(zhì)量保持一致。

炮制時(shí)間對(duì)結(jié)合蒽醌類成分含量影響很大，結(jié)合蒽醌有很強(qiáng)的瀉下作用，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，其結(jié)合蒽醌含量明顯降低，研究發(fā)現(xiàn)炮制約4～5 h時(shí)，結(jié)合蒽醌類成分降低幅度最大，為達(dá)到增效減毒的目的，初步將炮制時(shí)間設(shè)定4～5 h。與文獻(xiàn)[7]取得類似結(jié)果，避免高溫高壓對(duì)何首烏藥材成分產(chǎn)生較大影響，本文所述炮制方法與高壓蒸制相比，更適用應(yīng)用于臨床。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]