童凱　孫旭　姜美杰　李昭玲　王鈺　胡曉艷　呂明亮　田孟良

[摘要] 華重樓藥材供應(yīng)不足問題已嚴(yán)重制約下游產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。選育高產(chǎn)品種是生產(chǎn)上擴大華重樓藥材供給的重要途徑。合理株型是作物高產(chǎn)品種的生育基礎(chǔ)和形態(tài)特征，也是品種選育的重要方向。該研究對99份華重樓野生種質(zhì)資源的主要植物形態(tài)特征和根莖干重及其重樓皂苷含量進行考察分析，結(jié)果表明：①華重樓野生種質(zhì)資源存在廣泛的形態(tài)變異，變異幅度由高到低依次為皂苷含量、根莖干重、葉柄長、莖長、花瓣長、花梗長、萼片長、葉寬、葉長、萼片寬、葉片數(shù)、雄蕊數(shù)、花瓣數(shù)；②華重樓各形態(tài)性狀之間存在較強的相關(guān)性，主成分分析顯示其大體上綜合反映了華重樓的光合部位發(fā)育和生殖部位發(fā)育特征；③重樓皂苷Ⅶ，Ⅵ，Ⅱ，Ⅰ總量介于0.02%～0.87%，平均0.13%，與其他各農(nóng)藝性狀無顯著相關(guān)性。④華重樓高產(chǎn)選育應(yīng)當(dāng)重視具有大葉片、大萼片、高莖稈特征的種質(zhì)資源的利用。

[關(guān)鍵詞] 華重樓； 農(nóng)藝性狀； 單株產(chǎn)量； 重樓皂苷； 相關(guān)分析； 回歸分析； 主成分分析

Diversity of agronomic traits of Paris polyphylla var. chinensis and

their correlation with rhizome yield and active compositions

TONG Kai1， SUN Xu1， JIANG Meijie1， LI Zhaoling2， WANG Yu1，

HU Xiaoyan1， LV Mingliang1， TIAN Mengliang1，3*

（1.College of Agronomy， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China；

2.Maize Research Institute， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China；

3. Institute for New Rural Development， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

[Abstract] The supply deficiency of crude medicinal plant of Paris polyphylla var. chinensis has become a bottleneck for related medicinal industry. An important approach to increase herbal production is to breed highyield cultivated variety， which characterized ideal plant morphology. In the present study， we collected 99 wild germplasm resources of P. polyphylla and then measured their 12 main agronomic traits and contents of polyphyllin Ⅶ，Ⅵ，Ⅱ，Ⅰ. Followed analyses were used to characterize those traits and explore the potential connection with herbal yield or quality. The results showed that： ①There was ample morphological diversity in wild P. polyphylla， whose variation of agronomic traits reduced according to followed order： content of polyphyllin， weight of dry rhizome， petiole length， stem length， petal length， pedicel length， sepal length， leaf width， leaf length， sepal width， leaf number， stamen number， petal number. ② Most of those traits were significantly correlated to each other and generally represented the characterization of photosynthetic organs or reproductive organ. ③The total content of polyphyllin Ⅶ，Ⅵ，Ⅱ，Ⅰvaried between 0.02% and 0.87% and averagedat 0.13%， which showed no significant correlation with any agronomic trait. ④Plant breeders should play more attention on those germplasm resources with large leaves， large sepals and high stem.

[Key words] Paris polyphylla； agronomic traits； rhizome yield； polyphyllin； correlation analysis； regression analysis； PCA

華重樓Paris polyphylla Smith var. chinensis是《中國藥典》收載的“重樓”藥材的正品基原之一，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效，是云南白藥、抗病毒顆粒等著名中成藥的配方原料[1]。近20年來，重樓藥材一直處于供小于求的狀態(tài)，且市場缺口有逐年加大的趨勢，進而導(dǎo)致藥材價格大幅上漲，以及非法定品種的摻雜銷售，給下游制藥企業(yè)帶來極大的成本壓力和質(zhì)量隱患[2]。

發(fā)展華重樓人工栽培是解決華重樓藥材供應(yīng)困境，實現(xiàn)華重樓資源可持續(xù)發(fā)展的必需途徑[3]。而目前人工栽培的華重樓尚無審定品種，人工繁育的種苗亦未形成規(guī)模。各栽培基地仍然主要依靠野生采集的種源。四川地區(qū)邛崍山脈一帶是華重樓的主要分布區(qū)，境內(nèi)野生資源儲量較大，遺傳多樣性豐富，為華重樓高產(chǎn)品種選育提供了寬闊的潛在空間[45]。

華重樓以地下根莖部位入藥，其地下器官的生長發(fā)育與地上器官的生長發(fā)育是協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體。合理株型是高產(chǎn)品種的生育基礎(chǔ)和形態(tài)特征，也是品種選育的主要方向。因此，本研究收集并考察了99株野生華重樓的地下根莖地上部分主要農(nóng)藝性狀并分析其間的相關(guān)關(guān)系，以期為華重樓的品種選育提供指導(dǎo)。此外，為消除不同野生居群表型變異中的環(huán)境因素，本研究采用同質(zhì)園實驗，即將來源于不同居群的全部野生材料引種栽培于同一園地1年后再采集農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，以消除不同種質(zhì)材料間的環(huán)境影響因素后，重點考察各植株間的遺傳效應(yīng)[6]。

1 材料

1.1 藥材 野生華重樓P. polyphylla var. chinensis植株于2015年采集自四川邛崍山脈一帶，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)田孟良教授鑒定篩選后，統(tǒng)一栽培于四川省雅安市天全縣四川農(nóng)業(yè)大學(xué)?？h科技合作基地。

1.2 儀器 高效液相色譜儀Agilent1200，美國安捷倫（Agilent）科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH8，常州國華電器有限公司；1/1萬電子天平CP224S，德國賽多利斯（Sartorius）公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG91013SA，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；高速多功能粉碎機BJ100型，浙江愛雪廚房設(shè)備有限公司。

1.3 試劑 甲醇、乙腈、乙醇、磷酸均為色譜級，購買自賽默飛世爾科技（中國）有限公司和天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水由密理博公司MilliQ Bi℃el型超純水生產(chǎn)系統(tǒng)制備。重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ對照品購自于北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司。

2 方法

2.1 性狀考察 野生華重樓植株按照株行距30 cm×50 cm完全隨機栽培，爾后隨機選取99株健康植株，依次編號1～99，分別于2016年5月、7月、8月期間，分3次于田間實地考察各形態(tài)指標(biāo)。最后一次考察完畢后，采集所有材料回實驗室，取根莖部位，洗盡泥沙，除去須根，于70 ℃恒溫烘干測量根莖干重。

2.2 含量測定 精密稱取重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ適量配制成甲醇溶液，然后等體積混勻即得對照品溶液，其中各皂苷質(zhì)量濃度依次為0.33，0.35，0.33，0.35 g·L-1。另精密稱取重樓干燥粉末1 g，加入20 mL乙醇，80 ℃水浴提取30 min，冷卻定容后即得供試品溶液。按照如下色譜條件上機測定：色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速 0.6 mL·min-1；柱溫 30 ℃；檢測波長 203 nm；流動相 0.1%磷酸乙腈；梯度程序 0～40 min，30%～70%乙腈；40～50 min，70%～30%乙腈。

2.3 數(shù)據(jù)處理 色譜流出曲線保留時間及峰面積由安捷倫化學(xué)工作站軟件分析，數(shù)據(jù)的匯總和整理使用Excel軟件完成，各農(nóng)藝性狀相關(guān)描述統(tǒng)計量的計算以及主成分分析、相關(guān)分析、回歸分析均采用SPSS軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 華重樓主要農(nóng)藝性狀的變異特點 分別考察99份華重樓13個農(nóng)藝性狀的極小值、極大值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等描述統(tǒng)計量。結(jié)果顯示，13個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)界于22.33%～115.95%，以華重樓的總皂苷含量的變異幅度相對最大（93.91%），其次根莖干重（93.91%），葉柄長（91.63%）和莖長（55.43%），以花瓣數(shù)變異幅度相對最?。?2.33%）。寬闊的變異幅度，說明上述農(nóng)藝性狀有潛力作為育種選擇的目標(biāo)性狀進行遺傳改良，見表1。

3.2 華重樓主要農(nóng)藝性狀主成分分析 簡單相關(guān)分析表明，華重樓上述農(nóng)藝性狀中絕大數(shù)性狀之間都存在或強或弱的相關(guān)性（P<0.05）。為了更好地簡化變量并綜合解釋群體方差的主要來源，對上述99份材料的地上農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)采用主成分分析。結(jié)果顯示，以特征根值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，一共可提取出2個主成分，方差累計貢獻率71.14%，說明提取出的2個主成分可以基本代表原始數(shù)據(jù)的變異水平。根據(jù)各性狀的因子載荷圖可知，主成分1的取值主要受影響于葉數(shù)、葉柄長、葉寬、葉長、萼片寬、萼片長、花梗長、莖長等性狀，主要反映了華重樓葉部、莖部以及萼片等綠色光合部位特征，而主成分2的取值主要受影響于花瓣長、雄蕊數(shù)、花瓣數(shù)等性狀，主要反映了華重樓花部的生殖發(fā)育特征，見表2，圖1。

3.3 華重樓主要有效成分的含量測定 為了解各樣本藥材的質(zhì)量情況，本研究參照《中國藥典》2015年版要求，采用高效液相色譜法檢測藥材中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ的總含量。結(jié)果顯示，該99份野生華重樓材料總皂苷介于0.02%～0.87%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.13%。按照藥典中合格藥材中總皂苷含量不低于0.6%的標(biāo)準(zhǔn)，符合規(guī)定的樣品僅有3株。相關(guān)分析則表明，總皂苷含量與其他各項農(nóng)藝性狀均未表現(xiàn)出顯著性相關(guān)。這說明僅僅通過華重樓地上部分的生長發(fā)育特征來預(yù)測其地下根莖中總皂苷含量情況是困難的。

3.4 華重樓根莖干重與其主要農(nóng)藝性狀的回歸分析 為探討華重樓地上器官農(nóng)藝性狀對地下根莖干重的影響程度，擬對二者進行回歸分析?？紤]到各農(nóng)藝性狀間存在明顯的相關(guān)性，為避免變量之間的共線性對建模帶來的影響，故采用主成分回歸分析方法建模。結(jié)果顯示該模型的決定系數(shù)R2為0.706，主成分1標(biāo)準(zhǔn)化后偏回歸系數(shù)為0.84，主成分2標(biāo)準(zhǔn)化后的偏回歸系數(shù)為0.035。說明華重樓根莖干重主要決定于主成分1（即光合部位發(fā)育），而受主成分2（即生殖器官發(fā)育）的影響較弱。根莖干重（Y）與標(biāo)準(zhǔn)化后的主成分（Z主成分1，Z主成分2）回歸方程為，Y=0.840Z主成分1+0.035Z主成分2。根據(jù)主成分與原變量的線性關(guān)系，將上述主成分回歸方程還原為原始變量標(biāo)化后（Z）的回歸方程可得，Y=0.775Z花梗長+0.758Z葉長+0.755Z莖長+0.716Z萼片長+0.677Z葉柄長+0.621Z葉寬+0.614Z萼片寬+0.541Z葉數(shù)+0.373Z花瓣數(shù)+0.308Z雄蕊數(shù)-0.205Z花瓣長。比較各性狀標(biāo)準(zhǔn)化后偏回歸系數(shù)大小可知，與華重樓干重關(guān)系最為密切的農(nóng)藝性狀依次是花梗長、葉長、莖長、萼片長、葉柄長、葉寬、萼片寬、葉數(shù)、花瓣數(shù)、雄蕊數(shù)、花瓣長，見表3。

4 討論

從本實驗結(jié)果來看，絕大多數(shù)華重樓的總皂苷含量均難以滿足藥典要求，總體質(zhì)量不容樂觀。前人大量研究表明，重樓藥材中皂苷含量變異幅度極大，最高含量與最低含量的差異甚至可以達到數(shù)百倍以上[3]，而這與植物品種、采收時間、生長年限、貯藏期限、藥材部位、光照、溫度、海拔、土壤、肥力等多種因素密切相關(guān)[711]?？紤]到本研究中所收集的99份藥材樣品均采集自四川邛崍山脈地區(qū)，而且從莖痕判斷多數(shù)為5年以內(nèi)的小苗。因此，綜合前人研究結(jié)果推測本研究中華重樓皂苷含量偏低可能主要由于藥材生長年限不足所致。

另一方面，本研究考察了華重樓地上主要農(nóng)藝性狀與其地下根莖中總皂苷含量的相關(guān)性，盡管相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義，但是值得注意的是，均表現(xiàn)出一定的負相關(guān)趨勢。根據(jù)黃璐琦等提出的藥材道地性形成的“逆境效應(yīng)”假設(shè)，強調(diào)了環(huán)境脅迫對于藥材品質(zhì)形成的重要性[1213]。而本實驗中華重樓樣本自野外采集后于已實驗基地進行人工管理1年，其地上部分整體上生長較為茂盛，可能由于相對的“順境”更利于產(chǎn)量的形成，而缺乏了重樓皂苷積累的環(huán)境誘發(fā)條件。這在未來進行華重樓規(guī)范化栽培措施優(yōu)化時應(yīng)當(dāng)充分注意。

從本研究結(jié)果來看，影響華重樓產(chǎn)量（根莖干重）的農(nóng)藝性狀主要圍繞光合部位發(fā)育情況，次相關(guān)于生殖部位發(fā)育情況。按照植物生產(chǎn)的源庫流理論[14]，可以推測華重樓高產(chǎn)栽培的主要措施應(yīng)考慮如何加強“源”的供應(yīng)，即努力提高栽培群體的光合效率，比如通過使用葉片抗衰劑或生育后期輔助搭架防倒苗以增加華重樓的葉片持綠期，促進光合產(chǎn)物的合成和積累。從具體的形態(tài)特征上看，與華重樓產(chǎn)量最密切相關(guān)的性狀分別是花梗長、葉長、莖長、萼片長等，因此未來華重樓品種選育或株型調(diào)控的方向應(yīng)該重視培養(yǎng)大葉片、大萼片、高莖稈的形態(tài)類型。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]