韓建欣　袁濤

[摘要] 該研究旨在闡明維藥阿里紅的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。采用各種現(xiàn)代色譜手段（MCI，ODS，硅膠等柱色譜以及半制備高效液相色譜）從阿里紅甲醇提取物中分離得到2個(gè)新的羊毛甾烷型三萜酸成分，通過(guò)一維，二維核磁共振、高分辨質(zhì)譜等波譜手段鑒定其結(jié)構(gòu)為12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1），3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）。體外抗炎和細(xì)胞毒活性測(cè)試顯示，化合物1和2均未表現(xiàn)出抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的產(chǎn)生，以及抑制肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的活性。

[關(guān)鍵詞] 維藥； 阿里紅； 三萜酸； 抗炎； 細(xì)胞毒

Two new triterpenoid acids from Uighur medicine Fomes officinalis

HAN Jianxin 1，2， YUAN Tao 1*

（1. The Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Arid Zone， Chinese Academy of Sciences，

State Key Laboratory of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization， Xinjiang Technical

Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China；

2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

[Abstract] Two new lanostane triterpenoid acids， 12β， 15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid （1）， and 3α， 12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid （2）， were isolated from the methanolic extract of Uighur medicine Fomes officinalis. Their structures were elucidated based on the analysis of spectroscopic data （1D， 2D NMR and HRMS）. Antiinflammatory and cytotoxicity assays revealed that both compound 1 and 2 show no inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideinduced RAW264.7 cells， and no cytotoxicity activities against HepG2 cells.

[Key words] Uighur medicine； Fomes officinalis； triterpenoid acid； antiinflammatory； cytotoxicity

阿里紅Fomes officinalis （Vill. Ex Fr.） Ames，又名苦白蹄、落葉松茸，維吾爾語(yǔ)音譯為“哈里坤”，為一種藥用真菌子實(shí)體，屬于多孔菌科Polyporaceae層孔菌屬Fomes，主要分布于新疆、東北、內(nèi)蒙古等地[1]。阿里紅是我國(guó)新疆維吾爾民族醫(yī)生常用的治療藥物之一，民族醫(yī)生認(rèn)為其入藥性燥、熱，有溫胃祛痰、降氣平喘、祛風(fēng)除濕等功效，常用于治療慢性支氣管炎及哮喘等癥狀[1]。前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，阿里紅中的化學(xué)成分主要包括三萜酸類(lèi)成分、倍半萜、甾體類(lèi)化合物、多糖以及一些其他的直鏈烷烴類(lèi)結(jié)構(gòu)，其中以三萜酸類(lèi)成分最多[26]。阿里紅中分離得到的單體化合物的藥理活性的研究很少，大多集中在提取物以及阿里紅多糖的藥理作用研究，主要有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫以及平喘祛痰等作用[1]?；诒菊n題組對(duì)維吾爾醫(yī)常用藥材藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究興趣，前期已經(jīng)從阿里紅的甲醇提取物中分離得到9個(gè)三萜酸類(lèi)成分，且部分化合物表現(xiàn)出顯著的抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO作用[7]。在前期工作的基礎(chǔ)上，本課題組進(jìn)一步對(duì)阿里紅的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，通過(guò)采用各種現(xiàn)代色譜手段（MCI，ODS，硅膠等柱色譜以及半制備高效液相色譜），從中又分離得到2個(gè)新的羊毛甾烷型三萜酸類(lèi)成分，它們的結(jié)構(gòu)經(jīng)一維，二維核磁共振、高分辨質(zhì)譜等波譜手段鑒定為12β，15αdihydroxy24methyl3，23dioxolanosta7，9（11）dien26oic acid（1），3α，12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid（2）。對(duì)化合物1和2進(jìn)行了LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用以及HepG2細(xì)胞毒活性的評(píng)價(jià)。

1 材料

Varian 400 MHz核磁共振儀；美國(guó)魯?shù)婪駻utopol VI旋光儀；美國(guó)Thermo Fisher Nicolet 6700紅外光譜儀；ABsciex TripleTofTM 5600+高分辨質(zhì)譜儀；日立Chromaster高效液相色譜儀；瑞士步琦旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Phenomenex Luna C18 column （10 mm×250 mm，5 μm）半制備色譜柱；ODS （50 μm，日本YMC）；凝膠Sephadex LH20 （瑞典GE Healthcare BioSciences）； MCI （CHP20P，75～150 μm，日本三菱化工）；柱色譜硅膠（200～300目）及薄層色譜用GF254硅膠預(yù)制板，均為青島海洋化工廠(chǎng)生產(chǎn)；提取分離所用分析純?cè)噭┚?gòu)于探索平臺(tái)（上海）；半制備所用色譜純?cè)噭镾igmaAldrich；SANYO MCO18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices 公司；DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone；陽(yáng)性對(duì)照地塞米松購(gòu)于中檢所；腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7和肝HepG2購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。

阿里紅2014年11月購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所楊新平副研究員鑒定為F. officinalis子實(shí)體，其憑證標(biāo)本存放于中科院新疆理化技術(shù)研究所中科院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本號(hào)為FO201411。

2 提取與分離

室溫干燥的阿里紅子實(shí)體（1.0 kg），粉碎，用純甲醇室溫浸提3次，每次用4.5 L甲醇浸泡7 d。提取液減壓濃縮得浸膏575.9 g。甲醇提取物浸膏分散在蒸餾水中依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到2個(gè)萃取物浸膏。乙酸乙酯萃取浸膏（135.8 g）經(jīng)過(guò)MCI柱色譜，以甲醇水（50∶50～100∶0）梯度洗脫得到5個(gè)流分（A～E）。B流分（8.4 g）采用正相硅膠柱色譜，以氯仿甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脫得到7個(gè)流分（B1～B7）。B5（2.5 g）經(jīng)反相C18硅膠柱色譜分離甲醇水（6∶4～1∶0）洗脫得到8個(gè)流分（B5a～B5h）。B5a（462.5 mg）經(jīng)凝膠Sephadex LH20柱色譜分離純甲醇洗脫得到7個(gè)流分（B5a1～B5a7）。B5a4（182.0 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜分離氯仿甲醇（30∶1～10∶1）梯度洗脫得到6個(gè)流分（B5a4a～B5a4f）。B5a4a（103.2 mg）經(jīng)半制備HPLC（0～25 min， 60%～80%甲醇，流速為3 mL·min-1）制備得到化合物1（7.8 mg）。B5b（562.4 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜分離氯仿甲醇（100∶1～5∶1）梯度洗脫得到6個(gè)流分（B5b1～B5b6）。B5b6（48.8 mg）經(jīng)半制備HPLC（0～20 min，65%～77%甲醇，流速為3 mL·min-1）制備得到化合物2（5.1 mg）。

3 抗炎和細(xì)胞毒活性篩選

一氧化氮（NO）含量測(cè)定是采用Griess方法。具體如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，按每孔7×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，24 h后加入受試化合物（終濃度分別為40，13.3，4.33 μmol·L-1），1 h后加入LPS （1 mg·L-1）刺激24 h，無(wú)細(xì)胞上清液（50 μL）和50 μL 1%磺胺在5%磷酸溶液混合后在暗室下室溫孵育5 min，然后加入0.1%N（1萘基）乙二胺溶液50 μL，在酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，以NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校準(zhǔn)。地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照藥品。細(xì)胞毒活性測(cè)試采用的是常規(guī)的MTT法。抑制率按照以下計(jì)算：抑制率=（A模型-A給藥）/A模型×100%。

4 結(jié)構(gòu)鑒定和抗炎活性

化合物1 白色無(wú)定型粉末，[α]20D +10° （c 0.200，MeOH）；UV （MeOH） λmax 246 nm； IR νmax 3 376，2 926，1 699，1 566，1 453，1 408，1 022 cm-1；HRESIMS m/z 513.319 8 [M-H]-（計(jì)算值C31H45O6，513.321 6），結(jié)合核磁數(shù)據(jù)確定其分子式為C31H46O6，不飽和度為9。

從該化合物的1HNMR譜，見(jiàn)表1，可以清晰的觀(guān)察到5個(gè)叔碳甲基（δ 1.26，1.14，1.07，0.97，0.97，each 3H，s），3個(gè)仲碳甲基（δ 1.08，1.00，0.99，each 3H，d），2個(gè)烯氫信號(hào)（δ 6.00，br d，J=6.9 Hz，H7； 5.24，br s，H11），以及2個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)（δ 4.29，dd，J=8.9，6.3 Hz，H15； 4.24，br s，H12）。該化合物的13CNMR，見(jiàn)表1，顯示了31個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合HSQC譜將其分別歸類(lèi)為8個(gè)甲基、5個(gè)亞甲基、9個(gè)次甲基（其中包括2個(gè)sp2雜化碳）和9個(gè)季碳（其中包括3個(gè)羰基碳）。綜合分析以上數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物可能為24甲基羊毛甾烷型三萜[8]。在以上這些信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步詳細(xì)分析二維NMR（包括1H1H COSY，HSQC和HMBC）譜，該化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。首先由HSQC完成氫和與之相連的碳的歸屬，然后由1H1H COSY譜得出，見(jiàn)圖2，自旋偶合結(jié)構(gòu)片斷（粗線(xiàn)表示的），然后這些片斷再通過(guò)一些關(guān)鍵的HMBC 相關(guān)和其他一些官能團(tuán)連接起來(lái)。在HMBC譜中，可以觀(guān)察到Me19和C1（δ 36.3），C5（δ 50.6），C9（δ 145.4），C10（δ 36.8）；Me28（Me29）和C3（δ 217.5），C4（δ 47.1），C5，C29（C28）；H7和C9；H11和C8（δ 140.2）；Me18和C12（δ 73.5），C13（δ 49.3），C14（δ52.4），C17（δ 48.6）；Me30和C8，C13，C14，C15（δ 72.8）；Me21和C17，C20（δ 29.7），C22（δ 48.0）；H22和C23（δ 216.0）；Me31和C23，C24（δ 49.5），C25（δ 44.3）；Me27和C24，C25，C26（δ 182.7），見(jiàn)圖2a；以上這些HMBC相關(guān)就此構(gòu)建了化合物1的平面結(jié)構(gòu)。

化合物1的相對(duì)構(gòu)型主要采用NOESY譜確定，見(jiàn)圖2b。首先通過(guò)觀(guān)察NOESY譜可以發(fā)現(xiàn)H329和H319，H319和H318；H318和H15之間的相關(guān)，表明Me29，Me19，Me18和H15處于同一面，將它們定為β構(gòu)型；那么根據(jù)NOESY觀(guān)察到的H328和H5；H12和H330，H17之間的相關(guān)可以推測(cè)出Me28，H5，H12，Me30和H17為α構(gòu)型。C17側(cè)鏈的立體構(gòu)型則通過(guò)生源關(guān)系并對(duì)比它們的核磁數(shù)據(jù)得以確定[7]。因此，化合物1的結(jié)構(gòu)確離得到的化合物officimalonic acid D非常相似[6]，唯一的區(qū)別在于化合物2缺少officimalonic acid D的3位丙二酸半酯的核磁信號(hào)，且化合物2的3位氫信號(hào)和碳信號(hào)均向高場(chǎng)分別位移了1.33和4.2（2：δH3.38，δC 74.0，officimalonic acid D：δH 4.71，δC 78.2），因此，推測(cè)化合物2的3位OH沒(méi)有被?；?。HMBC相關(guān)信號(hào)Me28（Me29）和C3，C4，C5和C29（C28）進(jìn)一步支持了上述推斷。最后經(jīng)過(guò)綜合分析詳細(xì)分析2D NMR（包括1H1H COSY，HSQC，HMBC，NOESY）譜最終確定了化合物2的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，命名為12βdihydroxy24methyl7，23dioxolanosta8en26oic acid，經(jīng)Scifinder檢索為新化合物。

化合物1和2的絕對(duì)構(gòu)型是通過(guò)生源關(guān)系以及和已知類(lèi)似化合物[9]的核磁數(shù)據(jù)對(duì)照得以確定見(jiàn)圖1。

5 結(jié)果與討論

24甲基羊毛甾烷型三萜為多孔菌科真菌的特征性成分，前期從該科真菌中分離得到了大量的該類(lèi)成分[10]，結(jié)構(gòu)變化主要集中在C17側(cè)鏈，C3，C12和C15的取代基，C7，C8，C9和C11是否以雙鍵形式存在。前期其他課題組對(duì)阿里紅的研究也報(bào)道了該類(lèi)三萜成分[25]，課題組前期已經(jīng)從阿里紅中分離得到9個(gè)該類(lèi)型的三萜結(jié)構(gòu)（其中8個(gè)為新化合物）[7]，很有意思的是前期分離得到的化合物的3位都取代了1個(gè)丙二酸半酯的結(jié)構(gòu)片斷，這種結(jié)構(gòu)特征在多孔菌科的其他種中報(bào)道過(guò)[11]，但很少在阿里紅中有報(bào)道，并且部分化合物表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗炎活性，而本次報(bào)道的2個(gè)化合物的3位都沒(méi)有丙二酸半酯的片斷，且沒(méi)有表現(xiàn)出抗炎活性，所以推測(cè)抗炎活性可能與這一結(jié)構(gòu)特征有相關(guān)性。但是這種相關(guān)性需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。通過(guò)本研究的結(jié)果表明阿里紅中的具有豐富的24甲基羊毛甾烷型三萜，其結(jié)構(gòu)變化多樣，非常值得深入發(fā)掘。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]