唐 湖 郝心愿 王 璐 肖 斌 王新超,* 楊亞軍,,*

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茶樹(shù)越冬芽在休眠與萌發(fā)時(shí)期的物質(zhì)交流變化及其分子調(diào)控

唐 湖1,2,**郝心愿2,**王 璐2肖 斌1王新超2,*楊亞軍1,2,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院, 陜西楊凌712100;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國(guó)家茶樹(shù)改良中心/ 農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江杭州310008

為揭示不同萌發(fā)物候型茶樹(shù)的休眠機(jī)制, 以特早生茶樹(shù)品種龍井43和中生茶樹(shù)品種碧云為材料, 利用鈣黃素處理茶樹(shù)莖段, 檢測(cè)越冬芽在休眠與萌發(fā)時(shí)期與其他器官的物質(zhì)交流情況。利用同源比對(duì)鑒定胼胝質(zhì)水解相關(guān)基因, 并分析其序列特征及在冬季不同時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果表明, 越冬芽在茶樹(shù)生長(zhǎng)階段和休眠階段都存在著與著生莖段和母葉間的物質(zhì)交流; 從茶樹(shù)越冬芽休眠形成到解除的不同時(shí)期, 其物質(zhì)交流存在“強(qiáng)-弱-強(qiáng)”的變化規(guī)律, 但龍井43的與碧云相比存在較短的物質(zhì)交流減弱時(shí)期; 兩種茶樹(shù)的物質(zhì)交流變化模式與鑒定到的茶樹(shù)胼胝質(zhì)水解正向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)模式密切相關(guān); 啟動(dòng)子序列分析進(jìn)一步證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)有多個(gè)與激素信號(hào)以及低溫和休眠響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守序列。茶樹(shù)越冬芽在休眠和非休眠狀態(tài)下都存在與莖和母葉之間的物質(zhì)交流, 且物質(zhì)交流強(qiáng)弱與茶樹(shù)越冬芽休眠狀態(tài)改變密切相關(guān)?？赡苁菂⑴c胼胝質(zhì)水解調(diào)控, 改變茶樹(shù)越冬芽物質(zhì)交流水平, 進(jìn)而影響茶樹(shù)休眠狀態(tài)的關(guān)鍵基因。這對(duì)明確茶樹(shù)越冬芽休眠狀態(tài)變化和深入揭示不同萌發(fā)物候型茶樹(shù)休眠機(jī)理有重要意義。

茶樹(shù); 越冬芽休眠; 物質(zhì)交流; 鈣黃素

植物特別是多年生植物的整個(gè)生命周期中, 常常會(huì)遭遇惡劣環(huán)境條件, 植物的活躍生長(zhǎng)器官或組織進(jìn)入休眠狀態(tài)來(lái)增加對(duì)逆境的抵御能力, 安全度過(guò)不利的時(shí)期, 并在環(huán)境適宜時(shí)解除休眠, 重新恢復(fù)生長(zhǎng)。休眠是指含有分生組織的植物結(jié)構(gòu)可見(jiàn)生長(zhǎng)的暫時(shí)停止[1]。芽休眠是多年生木本植物最為常見(jiàn)的休眠方式, 其影響因素主要分為環(huán)境因素和生理因素; 包括日照、溫度、水分、激素、糖、胼胝質(zhì)的形成等[2]。在植物休眠與解除休眠過(guò)程中, 涉及到芽及其生長(zhǎng)部位以及其他器官之間的物質(zhì)交流, 包括水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等等[1]。也有研究表明, 在植物休眠與解除休眠過(guò)程中, 物質(zhì)運(yùn)輸?shù)臅匙枰蚕鄳?yīng)變化[3-4]。van der Schoot和Rinne[5]發(fā)現(xiàn), 糖作為信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 會(huì)從葉片運(yùn)輸?shù)窖? 影響芽休眠的形成和解除。胞間連絲是細(xì)胞間物質(zhì)交流的通道, 胼胝質(zhì)的形成和消解則是調(diào)控胞間連絲開(kāi)閉的重要途徑[6]。Rinne等[7-8]證實(shí)芽從休眠解除到處于可增生的活躍狀態(tài)是與1,3-b-D-葡聚糖在胞間連絲的活動(dòng)密不可分的。在植物芽休眠的不同階段, 休眠芽與其他器官的物質(zhì)交流狀態(tài)會(huì)發(fā)生明顯的變化, Rinne等[8]據(jù)此將芽休眠分為3個(gè)時(shí)期?；钴S期, 細(xì)胞間信號(hào)與物質(zhì)交流強(qiáng)度大; 休眠期, 胞間連絲被胼胝質(zhì)填充而關(guān)閉共質(zhì)體途徑, 交流被阻; 休眠解除期, 胼胝質(zhì)從胞間連絲括約肌和通道撤離, 共質(zhì)體組織活性恢復(fù)。

茶樹(shù)作為葉用為主的經(jīng)濟(jì)林木, 其芽葉的生長(zhǎng)與休止, 不僅關(guān)系到其對(duì)環(huán)境的適應(yīng), 且關(guān)系到其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9], 因此, 研究茶樹(shù)芽休眠形成與解除的機(jī)制具有重要的意義。前人對(duì)于茶樹(shù)越冬芽的研究, 主要集中在外界環(huán)境和激素動(dòng)態(tài)變化及相應(yīng)分子機(jī)制上。如錢利生等[10]、黃亞輝等[11]和禹利君等[12]研究了茶樹(shù)內(nèi)源激素GA3、ABA、IAA、ZT等對(duì)茶樹(shù)芽休眠和萌發(fā)的影響。王新超等[13-15]通過(guò)分子手段研究了相應(yīng)的分子機(jī)理, 如構(gòu)建茶樹(shù)休眠芽與萌動(dòng)芽的正、反向抑制消減雜交文庫(kù), 克隆細(xì)胞周期蛋白基因()、細(xì)胞周期素依賴激酶基因()等, 并分析它們?cè)诓煌菝唠A段的表達(dá)變化和表達(dá), 初步揭示了茶樹(shù)越冬芽休眠與解除的分子機(jī)理。但是在茶樹(shù)休眠形成和解除過(guò)程中, 對(duì)越冬芽如何與其他器官進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)交流的研究鮮有報(bào)道。另外, 茶樹(shù)為常綠木本植物, 冬季休眠階段成熟老葉并不脫落。成熟葉片中的物質(zhì)成分是否會(huì)影響相鄰腋芽的休眠仍未可知。

為明確冬季不同階段茶樹(shù)越冬芽與其他器官物質(zhì)交流的動(dòng)態(tài)變化及其分子調(diào)控機(jī)制, 本試驗(yàn)以不同萌發(fā)物候期茶樹(shù)為研究對(duì)象, 采用鈣黃素?zé)晒夥▉?lái)研究茶樹(shù)越冬芽在不同休眠階段與其他器官物質(zhì)交流的動(dòng)態(tài)變化, 通過(guò)鑒定葡聚糖酶基因及其表達(dá)模式, 驗(yàn)證胼胝質(zhì)在調(diào)控茶樹(shù)越冬芽與其他器官物質(zhì)交流中的作用, 初步揭示調(diào)控茶樹(shù)越冬芽休眠形成與解除的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為20年生國(guó)家級(jí)茶樹(shù)品種龍井43和碧云, 種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園。其中龍井43為特早生品種, 碧云為中生品種。

1.2 樣品采集

從2015年9月23日到2016年3月15日, 每間隔一段時(shí)間進(jìn)行采樣, 分別采集2個(gè)品種健康生長(zhǎng)的當(dāng)年生枝條, 立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后繼的鈣黃素處理, 同時(shí)采集同一時(shí)期2個(gè)品種的頂芽, 直接投入液氮, 隨后放入–80℃冰箱保存, 用于RNA提取。每次采樣設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 鈣黃素處理及熒光觀察

參考Rinne等[7]的方法, 配制0.1%鈣黃素(Sigma, C0875)并于4℃避光保存。采集枝條, 剪成一葉一芽的莖段, 隨后放入加有鈣黃素染液的50 mL離心管中, 染液以剛淹沒(méi)剪口為宜, 管口用脫脂棉封堵。將處理莖段置室溫24 h。之后除去母葉, 在熒光顯微鏡(尼康80i)下用4倍物鏡觀察腋芽熒光情況, 并使用Axio Vision Rel.4.6軟件照相。在照相時(shí)將鈣黃素染液處理樣品和對(duì)照樣品一起放在顯微鏡下, 分別在綠光和紫外光下觀察激發(fā)熒光。綠光通道下, 植物組織呈現(xiàn)紅色自發(fā)熒光, 紫外光下, 組織內(nèi)的鈣黃素受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光。

每個(gè)品種每次采樣所得莖段, 一半將莖底端沒(méi)入鈣黃素染液, 用于檢測(cè)“莖-芽”的物質(zhì)交流情況; 一半剪掉一半葉片后, 將葉片剪口端沒(méi)入染液, 檢測(cè)“葉-芽”的物質(zhì)交流情況。每種處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少處理5個(gè)莖段。以清水處理為對(duì)照。

1.4 胼胝質(zhì)水解相關(guān)基因的鑒定及序列分析

依據(jù)擬南芥及楊樹(shù)糖基水解酶17家族(Glycosyl hydrolase family 17)序列信息(https://www.arabidopsis. org/)[16-17], 通過(guò)與本實(shí)驗(yàn)室建立的茶樹(shù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì), 篩選目的基因。利用MEGA5建立基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù); 并利用Plant PAN2.0預(yù)測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列(http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/)。

1.5 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)

采用CTAB法[18]提取總RNA。分別利用NanoDrop ND-100微量核酸蛋白測(cè)定儀(Pittsburgh, PA, USA)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和完整性。取每個(gè)樣品5mg總RNA用于cDNA合成。cDNA采用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen, CA, USA)合成, 用超純水稀釋獲得產(chǎn)物20倍后作為qRT-PCR檢測(cè)模板。利用PrimerSelect (Lasergene 8, DNASTAR) 進(jìn)行的qRT-PCR引物設(shè)計(jì)(FP: 5￠-TGGTGGTGGTTCGGTTATTATT CTGC-3￠, RP: 5￠-GGATCGCCGGCCTATTCACTCG -3￠),作為內(nèi)參基因[19]。在ABI PRISM7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行qPCR, 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min; 95℃ 5 s, 62℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為10mL, 含5mLSYBR Green Master Mix+0.5mL FP引物+0.5mL RP引物+4mL cDNA模板。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2–ΔΔCT法分析, GraphPad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)“莖-芽”與“葉-芽”的物質(zhì)交流

從圖1可以看出, 2個(gè)品種在2個(gè)不同時(shí)期(活躍/休眠), “莖-芽”與“葉-芽”的都存在著一定程度的物質(zhì)交流, 只是物質(zhì)交流的強(qiáng)度不同, 在休眠階段, 無(wú)論是“莖-芽”還是“葉-芽”, 熒光反應(yīng)較弱, 表明休眠時(shí)茶樹(shù)芽與母葉以及著生部位節(jié)間的物質(zhì)交流不太活躍。而進(jìn)入活躍生長(zhǎng)期后, “莖-芽”和“葉-芽”的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng), 說(shuō)明此時(shí)芽與母葉以及節(jié)間活躍的物質(zhì)交流為芽的生長(zhǎng)提供了必要的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。

“莖-芽”處理越冬芽, A和B為活躍生長(zhǎng)期(2015-10-31)樣品, E和F為休眠期(2016-01-16)樣品; “葉-芽”處理越冬芽, C和D為活躍生長(zhǎng)期(2015-10-31)樣品, G和H為休眠期(2016-01-16)樣品。4倍物鏡觀察, 綠色熒光為鈣黃素在紫外光激發(fā)下的熒光信號(hào), 紅色熒光為越冬芽在綠光通道下的自發(fā)熒光。CTB: 鈣黃素處理; CK: 水處理對(duì)照。

In stem to bud treatment, samples A and B were active-growing buds (2015-10-31) and samples E and F were dormant buds (2016-01-16). In leaf to bud treatment, samples C and D were active-growing buds (2015-10-31) and samples G and H were dormant buds (2016-01-16). Pictures were taken under 4′objective lens. The green signals show fluorescence produced by calcein under UV light stimulation and the red signals show autofluorescence of bud under green light stimulation. CTB: calcein treatment; CK: control (H2O).

2.2 冬季不同時(shí)期的茶樹(shù)越冬芽與其他器官物質(zhì)交流動(dòng)態(tài)變化

從圖2看出, 在10月底到11月初, 茶樹(shù)芽感知外界信號(hào)的變化, 生長(zhǎng)發(fā)育逐漸從活躍轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài), 物質(zhì)交流的強(qiáng)度由強(qiáng)變?nèi)?。隨著時(shí)間的推移, 芽的休眠程度加深, 進(jìn)入了深度休眠狀態(tài), 此時(shí)的熒光反應(yīng)強(qiáng)度很弱, 說(shuō)明物質(zhì)交流極不活躍。進(jìn)入第2年春季以后, 隨著氣溫回升和光照時(shí)間增加, 芽的生長(zhǎng)發(fā)育也逐漸恢復(fù), 熒光強(qiáng)度逐漸增加, 說(shuō)明芽與著生部位之間的物質(zhì)交流強(qiáng)度提高, 為芽的萌發(fā)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

中生種碧云和特早生種龍井43春季萌發(fā)物候期存在明顯差異。雖然二者在冬季休眠形成到第2年春季萌發(fā)過(guò)程中, 越冬芽與其他器官物質(zhì)交流都存在“強(qiáng)-弱-強(qiáng)”的變化規(guī)律, 但是二者越冬芽與其他器官物質(zhì)交流強(qiáng)弱變化的時(shí)間和程度都存在明顯的不同。其中, 龍井43腋芽的熒光信號(hào)在12月份開(kāi)始逐漸減弱, 1月份最弱, 2月初開(kāi)始迅速加強(qiáng); 而碧云處理腋芽的熒光信號(hào)在11月份開(kāi)始減弱, 1月份和2月初最弱, 且熒光強(qiáng)度明顯弱于龍井43同時(shí)期腋芽, 2月底才逐漸加強(qiáng)。物質(zhì)交流變化的差異可能是影響茶樹(shù)春季萌發(fā)早晚的重要因素, 是反映越冬芽休眠狀態(tài)的重要指標(biāo)。

2.3 葡聚糖酶基因的鑒定及表達(dá)分析

通過(guò)同源比對(duì), 從茶樹(shù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了一條β-1,3-葡聚糖酶同源基因, 命名為茶樹(shù)β-1,3-葡聚糖酶基因1 (β-1,3-glucanase gene 1,), 基因序列已上傳至GenBank (KX982263)。因葡聚糖酶基因家族成員較多, 不同亞家族的基因成員的功能不同。為鑒定基因可能的功能, 利用該基因編碼氨基端序列, 與擬南芥葡聚糖酶基因家族成員及楊樹(shù)中已經(jīng)鑒定出的葡聚糖酶同源基因編碼蛋白一起構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。結(jié)果顯示CsGLU1為α亞家族成員, 與擬南芥中的AT5G42100.1蛋白同源性較高, 與楊樹(shù)中鑒定的GH17-33和GH17-65的同源性最高。為分析基因可能的調(diào)控因子, 對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)1500 bp長(zhǎng)度序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列進(jìn)行了分析(表1)。結(jié)果顯示, 該基因的啟動(dòng)子區(qū)有密集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列分布, 可以被多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控, 如bZIP、bHLH、dehydrin、AP2/ERF、Myb、B3/ARF/RAV、ARR、MADS/MIKC、WRKY及Homeodomain等。

為明確基因表達(dá)與物質(zhì)交流變化的關(guān)系, 檢測(cè)了基因在2個(gè)品種冬季不同時(shí)期的表達(dá)模式(圖4)。在龍井4中,表達(dá)水平在12月底前存在波動(dòng), 之后持續(xù)降低, 在第2年1月達(dá)到最低, 在3月初迅速上調(diào)。在碧云中,表達(dá)自11月底迅速下調(diào), 在12月中旬至第2年2月都保持較低的水平, 在3月初逐漸升高, 但是升高速率較慢。總之, 該基因在2個(gè)茶樹(shù)品種中都有一個(gè)表達(dá)水平較低的時(shí)期。我們將前面物質(zhì)交流檢測(cè)中, 越冬芽與其他器官物質(zhì)交流減弱的時(shí)期在圖4中標(biāo)出后, 發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)顯著下調(diào)的時(shí)期與物質(zhì)交流減弱的時(shí)期幾乎完全吻合。

3 討論

茶樹(shù)芽的休眠與解除是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程, 涉及基因表達(dá)、物質(zhì)代謝等變化, 同時(shí)受到多種內(nèi)外因素影響, 且與物質(zhì)的交流密切相關(guān)。Jian等[20]通過(guò)研究楊樹(shù)休眠芽細(xì)胞壁中胞間連絲的收縮和阻斷探索休眠時(shí)的物質(zhì)交流情況; 劉芳等[21]研究細(xì)葉百合鱗莖打破休眠時(shí)的形態(tài)及莖尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn), 當(dāng)休眠解除時(shí), 胞間連絲變粗, 細(xì)胞新陳代謝加強(qiáng), 胞間物質(zhì)交流經(jīng)多種途徑重新建立; Ruonala等[22]進(jìn)一步表明楊樹(shù)側(cè)芽與莖之間的物質(zhì)交流對(duì)于莖生長(zhǎng)和進(jìn)入休眠有重要作用。本試驗(yàn)證實(shí), 茶樹(shù)越冬芽的生長(zhǎng)狀態(tài)與其他器官的物質(zhì)交流水平密切相關(guān)。每年1~2月份為一年中溫度最低的時(shí)期, 此時(shí)茶樹(shù)處于深休眠時(shí)期, 芽與其他器官物質(zhì)交流明顯減弱。當(dāng)休眠芽與其他器官物質(zhì)交流加強(qiáng)后, 茶樹(shù)開(kāi)始萌動(dòng)。而且茶樹(shù)休眠及活躍生長(zhǎng)階段, “莖-芽”、“葉-芽”之間的物質(zhì)交流并無(wú)差異, 作為常綠木本植物, 母葉對(duì)腋芽休眠的影響還有待進(jìn)一步研究。

Rinne等[7]用赤霉素處理?xiàng)顦?shù)休眠芽, 發(fā)現(xiàn)有解除休眠的作用。通過(guò)進(jìn)一步的鈣黃素處理和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 在用赤霉素處理休眠芽后, 休眠芽與其他器官的物質(zhì)交流的通道被打開(kāi), 胞間的胼胝質(zhì)被水解。說(shuō)明胞間胼胝質(zhì)的形成和水解是調(diào)控植物芽休眠形成和解除的重要機(jī)制。近來(lái), Rinne等[17]證實(shí)β-1,3-葡聚糖酶基因是響應(yīng)赤霉素信號(hào)的下游基因。β-1,3-葡聚糖酶是一個(gè)復(fù)雜的多基因家族, 參與抗病、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重塑等多種生理和發(fā)育過(guò)程, 具有水解胼胝質(zhì)的活性[16]。擬南芥中被鑒定的葡聚糖酶基因有50個(gè), 被分為α、β和γ亞家族。該基因家族成員都含有一個(gè)N端信號(hào)肽和一個(gè)糖基水解酶17家族的保守域, 只有α亞家族成員可以定位到胞間連絲[23]。在楊樹(shù)中已鑒定到的葡聚糖酶基因約100個(gè), α和γ亞家族成員都可以定位到胞間連絲[24]。但是在赤霉素信號(hào)誘導(dǎo)下, α亞家族基因表達(dá)會(huì)被顯著上調(diào), 相反γ亞家族基因表達(dá)被顯著下調(diào)[17]。Nagar等[25]檢測(cè)了茶樹(shù)多種內(nèi)源激素從休眠形成到休眠解除過(guò)程中的含量變化, 結(jié)果表明自由態(tài)的赤霉素濃度在茶樹(shù)休眠形成和深休眠階段都處于較低的水平,而在休眠解除前快速升高。本研究中鑒定到的β-1,3-葡聚糖酶基因?yàn)棣羴喖易寤? 在赤霉素信號(hào)誘導(dǎo)下應(yīng)上調(diào)表達(dá)[17]。表達(dá)結(jié)果顯示, 該基因在茶樹(shù)越冬芽休眠解除階段表達(dá)顯著上調(diào)。表明該基因可能通過(guò)改變胞間連絲周圍胼胝質(zhì)的水解速率來(lái)調(diào)控越冬芽與其他器官的物質(zhì)交流通道, 進(jìn)而影響茶樹(shù)越冬芽休眠的解除。

采樣日期為2015-10-31 (A和B)、2015-11-16 (C和D)、2015-12-17 (E和F)、2016-01-06 (G和H)、2016-02-02 (I和J)、2016-02-25 (K和L)及2016-03-09 (M和N)。4倍物鏡觀察, 綠色熒光為鈣黃素在紫外光激發(fā)下的熒光信號(hào), 紅色熒光為越冬芽在綠光通道下的自發(fā)熒光。CTB: 鈣黃素處理; CK: 水處理對(duì)照。

The sampling dates were 2015-10-31 (A and B), 2015-11-16 (C and D), 2015-12-17 (E and F), 2016-01-06 (G and H), 2016-02-02 (I and J), 2016-02-25 (K and L), and 2016-03-09 (M and N). Pictures were taken under 4′objective lens. The green signals show fluorescence produced by calcein under UV light stimulation and the red signals show autofluorescence of bud under green light stimulation. CTB: calcein treatment; CK: control (H2O).

藍(lán)色、紅色和紫色字體分別顯示α、β和γ亞家族基因。■擬南芥葡聚糖酶基因家族; ▼楊樹(shù)葡聚糖酶基因家族; ●茶樹(shù)CsGUL1。

α-, β-, and γ-clade genes are in blue, red, and purple font, respectively. ■ Genes from; ▼ Genes from; ● CsGLU1.

表1 CsGLU1啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息

(續(xù)表1)

模型編碼Matrix ID轉(zhuǎn)錄因子家族Family結(jié)合位點(diǎn)Position to ATG方向Strand匹配度Similar score匹配序列Hit sequence TF_motif_seq_0255AP2; RAV; B3–138–1.00TGTTG TFmatrixID_0461WRKY–140–0.98aatgTTGACg TFmatrixID_0154AT-Hook–189+1.00aAAATAat TFmatrixID_0099Myb/SANT; trp; MYB–199+0.87agcTCAGCcca TFmatrixID_0508MADS box; MIKC–225+0.88cCAAAAtagca TF_motif_seq_0252Myb/SANT; MYB; ARR-B–244+1.00GGATT TFmatrixID_0051LOB; LBD–248+0.96atCCGGAttc TFmatrixID_0486Myb/SANT; ARR-B–250–1.00AGATCcgg TFmatrixID_0156B3; ARF–259+0.96tgCGACAga TFmatrixID_0605B3–503–0.86aaaTACACgg TFmatrixID_0047bZIP; Homeodomain; HD-ZIP–670+0.92ccaATTATta TFmatrixID_0392NAC; NAM–713–1.00gatcACGCAa TFmatrixID_0302Homeodomain–763–0.98gGACTAagct TF_motif_seq_0251TCP–826+1.00GCCCG TF_motif_seq_0072HD-ZIP–835–0.82gcaatgAATGC TFmatrixID_0089AP2;B3;RAV–974+0.96cggCAACAggat TF_motif_seq_0331TCP–1023+1.00tCGGGT TFmatrixID_0283Homeodomain; HD-ZIP–1072+0.96aggTGATTga TFmatrixID_0589MYB–1090–0.93ggtTGGTTca TFmatrixID_0495BES1–1109–0.97cggacACGTGgcgc TFmatrixID_0636C2H2–1116+0.94atCAGCTcgg TFmatrixID_0050Myb/SANT; MYB;G2-like–1225+0.92gacTATTCtc TFmatrixID_0359Myb/SANT; G2-like–1285+0.99caaGAATCtt TFmatrixID_0057AP2; RAV–1303+0.94aCAACAtt TFmatrixID_0256EIN3; EIL–1358–0.99cgaTGCATga

的表達(dá)模式分析表明, 該基因的表達(dá)水平與茶樹(shù)越冬芽與其他器官物質(zhì)交流的強(qiáng)弱變化密切相關(guān), 而且在不同萌發(fā)物候期的茶樹(shù)品種中的表達(dá)模式不同。該試驗(yàn)結(jié)果不但揭示了胼胝質(zhì)在調(diào)控物質(zhì)交流中的重要作用, 同時(shí)對(duì)于快速鑒定茶樹(shù)越冬芽休眠狀態(tài)有重要意義。為進(jìn)一步了解該基因可能的調(diào)控機(jī)制, 我們分析了該基因的啟動(dòng)子序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該基因啟動(dòng)子區(qū)有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列, 這些轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與植物多種的激素反應(yīng)、抗逆及生理發(fā)育過(guò)程。在茶樹(shù)抗寒研究中已證實(shí), bZIP基因家族部分成員參與茶樹(shù)低溫響應(yīng)的調(diào)控[26]。激素及脫水蛋白等相關(guān)基因在茶樹(shù)冷馴化過(guò)程中存在顯著表達(dá)差異[27]。生長(zhǎng)素調(diào)控相關(guān)的ARF家族基因也參與了茶樹(shù)的休眠調(diào)控[28]。MADS家族的基因被認(rèn)為是參與植物休眠調(diào)控的關(guān)鍵基因[2, 29]。推測(cè)基因可能是茶樹(shù)休眠調(diào)控的下游基因, 受多個(gè)休眠相關(guān)的信號(hào)途徑共同調(diào)控。植物休眠是受光周期、溫度等多種環(huán)境因素共同作用的結(jié)果, 多種激素及光周期、溫度感受基因參與這一過(guò)程[2]。對(duì)單個(gè)信號(hào)的研究很難檢測(cè)植物的休眠狀態(tài), 深入研究基因的作用機(jī)制, 對(duì)于準(zhǔn)確鑒定越冬芽的休眠狀態(tài)有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

茶樹(shù)芽與莖及其母葉都有著相似強(qiáng)度的的物質(zhì)交流; 茶樹(shù)芽從活躍期到休眠再到活躍時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)可以通過(guò)熒光反應(yīng)的強(qiáng)弱來(lái)反映; 2個(gè)茶樹(shù)品種休眠解除時(shí)間及休眠期的長(zhǎng)短與越冬芽物質(zhì)交流強(qiáng)弱密切相關(guān)。茶樹(shù)基因是參與胼胝質(zhì)水解正向調(diào)控的基因, 其冬季不同時(shí)期的表達(dá)模式與物質(zhì)交流強(qiáng)弱變化存在一致性。胼胝質(zhì)水解調(diào)控可能是影響物質(zhì)交流變化的必要機(jī)制。

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在本次調(diào)查期間，參與口語(yǔ)報(bào)告檢測(cè)的學(xué)生共有45名，其中學(xué)習(xí)質(zhì)量相對(duì)較好、學(xué)習(xí)質(zhì)量中等、學(xué)困生各15名。

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Molecular Regulation and Substance Exchange Dynamics at Dormancy and Budbreak Stages in Overwintering Buds of Tea Plant

TANG Hu1,2,**, HAO Xin-Yuan2,**, WANG Lu2, XIAO Bin1, WANG Xin-Chao2,*, and YANG Ya-Jun1,2,*

1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Early-sprouting cultivar Longjing 43 and late-sprouting cultivar Biyun were employed in this study to disclose the dormancy mechanism in tea plant with different sprouting phenophases. The levels of substance exchange were monitored by detecting the fluorescence signal in calcein treated overwintering buds. The glucanase related genes were identified by sequence homology analysis. Their characteristics and expression patterns during different time of winter were further analyzed. The substance exchanges were detected either in stem-bud unit or mother leaf-stem unit. From the initial formation to release in dormancy, the substance exchange in overwintering buds showed strong-weak-strong variation patterns in both cultivars, however, the duration of weak exchange stage was much shorter in Longjing 43 than in Biyun. Moreover, there was a close correlation between substance exchange variation pattern and the expression pattern of, a gene identified in tea plant with positive callose hydrolyzation activity. On the basis of promoter sequence analysis, plenty of transcription factor binding sequences related to hormone signaling, cold stimulation and dormancy regulation were found inpromoter region, which validates its putative functions in dormancy regulation. In conclusion, overwintering buds of tea plant have substance exchange with stem and mother leaf both in dormancy and non-dormancy status, furthermore, the variation of substance exchange level was consistent to the changes of dormancy status.is a callose hydrolyzation related gene, which is supposed to be a key gene regulating tea plant dormancy transition through affecting the substance exchange in overwintering buds. The study provides meaningful results for understanding the changes of dormancy statuses in overwintering buds and deeply exploring the regulation mechanism in tea plant with different sprouting phenophase.

Tea plant; Overwinter bud dormancy; Substances exchange; Calcein

10.3724/SP.J.1006.2017.00669

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370690), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-23)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370690), the China Agriculture Research System (CARS-23), and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).

(Corresponding authors): 王新超, E-mail: xcw75@tricaas.com, Tel: 0571-86653162 ; 楊亞軍: Email: yjyang@tricaas.com

唐湖, E-mail: tanghu@tricaas.com; 郝心愿, E-mail: haoxy@tricaas.com, Tel: 0571-86653162

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

(收稿日期): 2016-10-17; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1020.030.html