徐 熠 彭 陽 李 帥 趙秋棱 張雙娟 李加納 倪 郁

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甘藍型油菜烷羥化酶基因的克隆與表達分析

徐 熠**彭 陽**李 帥 趙秋棱 張雙娟 李加納 倪 郁*

西南大學農(nóng)學與生物科技學院, 重慶 400715

在植物蠟質(zhì)合成途徑中, 中鏈烷烴羥化酶(mid-chain alkane hydroxylase, MAH) 催化烷烴羥基化形成二級醇, 進一步氧化為酮。本研究以擬南芥P450依賴性酶CYP96A15/MAH1基因為探針, 采用電子克隆與RT-PCR技術(shù), 獲得2個甘藍型油菜的全長編碼區(qū)序列, 分別命名為和(GenBank登錄號分別為KT795344和KT795345)。二者ORF長度均為1491 bp, 無內(nèi)含子, 核苷酸與氨基酸序列分別有92.4%與90.9%的一致性。根據(jù)編碼區(qū)預測的BnMAH1-1和BnMAH1-2前體蛋白均為包含496個氨基酸殘基的多肽鏈, 具有典型的P450蛋白家族保守結(jié)構(gòu)P415xR417x、K螺旋(E359xxR362)、C末端的血紅素結(jié)合域(F436xxGxRxCxG445) 以及氧結(jié)合帶保守區(qū)域(A/G)G309x(D/E)T312(T/S)。NCBI BlastN、氨基酸序列多重比對與系統(tǒng)學分析表明, 兩者與擬南芥/同源性最高。實時熒光定量PCR表明,與主要在甘藍型油菜莖、葉、花、及角果中表達, 其中在葉片中的表達量最高, 在根系中的表達量很低, 這與角質(zhì)層蠟質(zhì)主要沉積在植株地上部分相一致。和在無蠟粉材料莖、葉片中幾乎不表達, 表明蠟質(zhì)的減少與的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。與受SA、MeJA、ACC、ABA、NaCl及干旱脅迫誘導表達, 其中可能在水分脅迫響應中起主要作用。

甘藍型油菜; 角質(zhì)層蠟質(zhì); 烷羥化酶

植物地上部分表面覆蓋的角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一層屏障, 具有多種生理和生態(tài)功能, 例如限制植物非氣孔性水分散失[1-2]、防止外源病蟲害侵入[3-4]、阻擋紫外線輻射[5-6]及降低灰塵、花粉和空氣中的污染物在植物表面沉積等[7-8]。開展植物角質(zhì)層蠟質(zhì)代謝、運輸和相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡的研究, 對通過育種和栽培手段調(diào)控角質(zhì)層以提高植物抗逆性有重要意義。目前在水稻、番茄、亞麻薺等作物中已有一些利用蠟質(zhì)相關(guān)基因提高作物產(chǎn)量和抗旱性的研究報道[9-11]。植物角質(zhì)層蠟質(zhì)主要是由碳原子數(shù)在20~34之間的超長鏈脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物(包括烷烴、醇、醛、酮、酯等)組成, 其中一級醇、酯類等主要由VLCFAs經(jīng)?；€原途徑生成, 而烷類、二級醇和酮類等組分主要由VLCFAs經(jīng)脫羰基途徑生成[12]。Kolattukudy等[13]對甘藍葉片的體外前體物質(zhì)同位素標記試驗證實, 烷烴和二級醇能夠轉(zhuǎn)化為酮類物質(zhì)。擬南芥中, 細胞色素P450依賴性酶CYP96A15可催化烷烴羥基化生成二級醇, 進一步氧化成酮, 因此被稱為中鏈烷烴羥化酶(MAH)[14]。

油菜是全世界廣泛種植的一種油料作物, 也是我國第五大作物, 具有典型的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)。通常情況下, 甘藍型油菜葉和莖表皮均有蠟粉覆蓋。甘藍型油菜光葉突變體中與其他蠟質(zhì)合成基因表達均下調(diào)[15]。白菜型油菜脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因在甘藍型油菜中超表達導致葉片蠟質(zhì)沉積減少, 并影響細胞分裂和花的發(fā)育[16]。MeJA與ACC處理顯著誘導甘藍型油菜中雙11角質(zhì)層蠟質(zhì)總量與蠟質(zhì)晶體密度的增加, 蠟質(zhì)組分中烷類、次級醇類、酮類顯著增加[17]。有關(guān)油菜蠟質(zhì)基因功能研究鮮見報道, 本研究克隆甘藍型油菜中鏈烷烴羥化酶基因, 并進行生物信息學分析與基因表達分析, 以期為通過育種和栽培手段調(diào)控角質(zhì)層、提高油菜逆境脅迫的耐受性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和菌種

甘藍型油菜中雙11與無蠟粉材料NoWax, 由西南大學油菜工程中心提供。將其按常規(guī)方法種植, 采集中雙11根、莖、葉、花、角果, 儲存于–80℃, 用于基因組DNA與RNA的提取。采集NoWax材料的莖、葉用于RNA的提取。大腸桿菌()菌株DH5α感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 激素及脅迫處理

采用溶液培養(yǎng)(以1/10的MS溶液配制培養(yǎng)液), 待中雙11水培幼苗長至5片真葉時, 分別進行激素、鹽脅迫與低溫脅迫處理。激素處理是分別用200 μmol L–1水楊酸(SA)、100 μmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)、20 μmol L–1脫落酸(ABA)及200 μmol L–1乙烯合成促進劑1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)處理6 h。鹽脅迫處理是用100 mmol L–1NaCl溶液處理6 h。低溫脅迫是幼苗在4℃下培養(yǎng)24 h。干旱脅迫處理是采用盆栽試驗, 待幼苗長至5片真葉時連續(xù)7 d干旱, 對照組正常澆水。處理結(jié)束后, 取上述材料的葉片保存于–80℃, 用于RNA提取。

1.3 基因組DNA、總RNA的提取與cDNA合成

采用CTAB法提取基因組DNA。采用TransZol RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取總RNA。用DNase I (TaKaRa)消化去除基因組DNA。依照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行樣品mRNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.4 電子克隆

以擬南芥為信息探針, 對甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen-ome/203)進行同源性Blast檢索分析。對檢索到的甘藍型油菜相關(guān)序列進行人工拼接與計算機軟件預測, 獲得包括完整ORF在內(nèi)的相應基因的序列。

1.5 PCR擴增

根據(jù)電子克隆序列設計PCR引物BnMAH1- 1F/BnMAH1-1R、BnMAH1-2F/BnMAH1-2R (表1), 以中雙11的cDNA與基因組DNA分別為模板擴增, PCR體系含10×PCR緩沖液(Mg2+) 5 μL、2.5 mmol L–1dNTPs 4 μL、10 μmol L–1上下游引物各1.5 μL、5 U μL–1酶0.8 μL、模板2.5 μL、加ddH2O 34.7 μL補足50 μL。其程序為94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測, 回收目的片段, 與載體(pMD-19T Vector)連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài), 篩選陽性克隆并測序。

1.6 生物信息學分析

利用Vector NTI Advance 11. 5軟件進行序列比對、翻譯及繪制進化樹, 在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上搜索GenBank Blast, 在http:// bip.weizmann.ac.il/和http://www.expasy.org/進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、保守域、功能域分析。

表1 甘藍型油菜MAH1基因克隆引物與熒光定量PCR引物

1.7 實時熒光定量PCR

根據(jù)實際克隆獲得的序列設計熒光定量PCR引物BnMAH1-1Fq/BnMAH1-1Rq、BnMAH1-2Fq/ BnMAH1-2Rq (表1), 在qTOWER2.2熒光定量PCR儀(德國耶拿)上擴增。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)說明配制反應體系, 含2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL、10 μmol L–1上下游引物各0.4 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。擴增程序為95℃30 s; 95℃ 5 s, 56℃ 30 s, 40個循環(huán)。作為內(nèi)參基因, 設置3個生物學重復, 2個技術(shù)重復。

1.8 葉角質(zhì)層蠟質(zhì)的提取與組分分析

參考倪郁等[17]方法采集甘藍型油菜展開葉片,于含氯仿的大試管內(nèi)浸提1 min, 氯仿中預先加入已知濃度的C24烷作為內(nèi)標。用氮吹儀蒸干浸提液, 再于70℃下用20 μL BSTFA與20 μL吡啶衍生45 min, 再次用氮吹儀蒸干, 將產(chǎn)物溶于200 μL氯仿中。用氣相色譜儀(福立9790II, 浙江)分析測定蠟質(zhì)組分及含量。氣相色譜的毛細管柱長30 m, 直徑為0.32 mm, 液膜厚度0.25 μm; 以氮氣作為載氣; 使用FID (火焰離子化檢測儀)為檢測器; 柱膜和FID檢測器的溫度分別為300℃和320℃; 使用的升溫程序為初溫80℃, 保持0.1 min, 后以15℃ min–1升至245℃, 保持5 min, 再以19℃ min–1升至325℃, 保持12 min。根據(jù)FID的峰面積確定蠟質(zhì)的量, 利用GC-MS (島津GC2010MS, 日本)鑒定蠟質(zhì)組分, 參考內(nèi)標正二十四烷計算各蠟質(zhì)組分的實際含量(μg cm–2)。利用數(shù)字化掃描儀(EPSON V750)和WinFOLIA葉片專業(yè)圖像分析軟件(Regent Instrument Inc, Canada)測定并記錄葉面積。每處理4個重復。

1.9 葉表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

將葉片干燥后用碳導電膠布固定在載物臺上, 放入金屬離子濺射儀(E1010, Hitachi)內(nèi)噴鍍導電膜, 于掃描電子顯微鏡(S3000-N, Hitachi)下觀察鍍金材料的形態(tài)。每處理4個重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型油菜的克隆與序列分析

克隆到的2條序列ORF長度均為1491 bp, 無內(nèi)含子, 編碼496個氨基酸, 被分別命名為(GenBank登錄號為KT795344)和(GenBank登錄號為KT795345)。二者的核苷酸序列一致性為92.4%, 氨基酸序列一致性為90.9%。GenBank Blast搜索表明,和與擬南芥最同源。將推導的BnMAH1-1與BnMAH1-2蛋白與擬南芥P450家族成員以及亞麻薺() MAH1蛋白進行氨基酸序列多重比對(圖1)。BnMAH1-1、BnMAH1-2與擬南芥CYP96A15最同源, 分別有77.7%/85.7%、80.7%/ 88.8%的序列一致性/相似性, 其次是亞麻薺CsMAH1, 序列一致性/相似性為66.8%/77.0%、67.2%/76.8%。系統(tǒng)進化分析(圖2)表明, BnMAH1-1與BnMAH1-2首先與擬南芥CYP96A15聚在一起形成一個亞組, 然后與亞麻薺MAH1聚在一起, 之后依次與擬南芥CYP86家族的其他亞家族成員、CYP其他多家族成員聚在一起, 最后與CYP單家族成員聚集。蛋白質(zhì)序列同源比對發(fā)現(xiàn), BnMAH1-1、BnMAH1-2具有典型的P450蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域, 即P415xR417x結(jié)構(gòu)域、K螺旋(E359xxR362)以及C末端的血紅素結(jié)合域(F436xxGxRxCxG445), 同時還具有高度保守的(A/G)G309x(D/E)T312(T/S)序列, 是一個含蘇氨酸(T)的氧結(jié)合帶保守區(qū)域(圖1)。

2.2與在甘藍型油菜中的組織器官特異性表達特征

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3),與主要在甘藍型油菜莖、葉、花及角果中表達, 其中在葉片中的表達量最高, 其次是在角果和莖中, 而在根系中的表達量最低。的表達量在莖和葉片中高于, 在花和角果中略低于。

參加比對的有擬南芥P450家族成員AtCYP96A15(AT1G57750)、AtCYP86A4(AT1G01600)、AtCYP94C1(AT2G27690)、AtCYP72B1 (AT2G26710)、AtCYP71B2(AT1G13080)及亞麻芥CsMAH1(KJ461887)。圖中完全相同、基本相同與相似程度低的氨基酸殘基分別用黑色、深灰色與淺灰背景表示, 不相似氨基酸殘基無背景色; 下畫線加著重號表示的是細胞色素P450酶系中的保守結(jié)構(gòu)域。

The P450 proteins (accession numbers in parentheses) AtCYP96A15 (AT1G57750), AtCYP86A4 (AT1G01600), AtCYP94C1 (AT2G27690), AtCYP72B1 (AT2G26710) and AtCYP71B2 (AT1G13080) from, and MAH1 (KJ461887) fromare aligned. In the panel, identical, conservative, weakly similar and non-similar residues are denoted with the background of dark, dark gray, light gray and white, respectively. In consensus line the conserved residues and domains are underlined and doted.

AtCYP96A15(AT1G57750)、AtCYP86A4(AT1G01600)、AtCYP94C1(AT2G27690)、AtCYP72B1(AT2G26710)、AtCYP71B2(AT1G13080)、AtCYP51A2(AT1G11680)、AtCYP74A(AT5G42650)、AtCYP704B1(AT1G69500)來自擬南芥P450家族, CsMAH1(KJ461887)來自亞麻芥。

AtCYP96A15 (AT1G57750), AtCYP86A4 (AT1G01600), AtCYP94C1 (AT2G27690), AtCYP72B1 (AT2G26710), AtCYP71B2 (AT1G13080), AtCYP51A2 (AT1G11680), AtCYP74A (AT5G42650), and AtCYP704B1 (AT1G69500) are from P450 proteins of, andCsMAH1 (KJ461887) from.

2.3與在有蠟粉與無蠟粉材料中的表達

甘藍型油菜中雙11葉表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)以桿狀、顆粒狀(小型片狀)為主, 而無蠟質(zhì)材料NoWax葉表面無蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)覆蓋(圖4)。GC-MS分析結(jié)果表明, 與中雙11相比, NoWax材料葉角質(zhì)層蠟質(zhì)各組分含量以及蠟質(zhì)總量均顯著下降, 其中酮含量下降92.87% (圖5)。由圖6可知,和在ZS11莖、葉片中均有表達, 而在NoWax材料莖中表達量很低, 在葉片中幾乎不表達。

2.4與在不同脅迫處理下的表達

熒光定量PCR結(jié)果表明(圖7), SA、MeJA、ACC以及ABA均不同程度地誘導和的表達, 其中MeJA、ABA誘導表達上調(diào)10倍以上。NaCl及干旱脅迫下,和表達均顯著上調(diào), 而低溫脅迫下和表達均顯著下調(diào)。

3 討論

植物角質(zhì)層是植物與外界環(huán)境的第一接觸面, 是植物應對生物和非生物逆境的重要屏障, 其中的角質(zhì)層蠟質(zhì)是由堆積在角質(zhì)層最外層有獨特三維結(jié)構(gòu)的表皮蠟質(zhì)和填充于角質(zhì)中的內(nèi)部蠟質(zhì)組成, 具有多種生理和生態(tài)學功能。角質(zhì)層蠟質(zhì)主要由VLCFAs、烷烴、一級醇、二級醇、酮、醛、酯等組成。前人利用反向遺傳學的方法在擬南芥莖中發(fā)現(xiàn)了一個與二級醇和酮合成相關(guān)的細胞色素P450依賴性酶CYP96A15, 稱之為中鏈烷烴羥化酶(MAH1)[14]。P450基因是一個古老的超基因家族, 基于蛋白序列的相似性和親緣關(guān)系, 陸生植物P450可分為11簇, 歸為單家族簇(CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746)和多家族簇(CYP71、CYP72、CYP85、CYP86) 2類。擬南芥中發(fā)現(xiàn)有272個P450基因, 其中CYP86家族簇包含33個基因, 分別聚類在CYP86、CYP94、CYP96和CYP704家族中[18-19]。擬南芥CYP96家族中包含8個亞家族, 分別為CYP96A、CYP96B、CYP96C、CYP96D、CYP96E、CYP96F、CYP96G和CYP96H, 其中CYP96A亞家族包含15個基因成員, 到目前為止,只有CYP96A15被發(fā)現(xiàn)與角質(zhì)層蠟質(zhì)合成有關(guān), 最終被鑒定為MAH。本研究以擬南芥基因為探針, 從甘藍型油菜中克隆了2個MAH1基因和。在核苷酸水平與氨基酸水平上, 這2個基因與擬南芥同源性最高、與亞麻薺其次。多重比對及系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果表明, BnMAH1-1和BnMAH1-2首先與CYP96A15聚在一起, 其次與CYP86, 再次與其他P450家族成員聚在一起。前人研究表明, 細胞色素的三維結(jié)構(gòu)非常保守, 其中保守的血紅素結(jié)合域FxxGxRxCxG序列是鑒定P450類蛋白的主要特征[20-21]。和氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明, 它們在第436至第445個氨基酸處均含有血紅素結(jié)合域FxxGxRxCxG (圖1)。該結(jié)構(gòu)域中存在與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對保守的半胱氨酸(C)殘基。此外, BnMAH1-1和BnMAH1-2中還含有P450的其他保守結(jié)構(gòu)域P415xR417x、K螺旋(E359xxR362)及氧結(jié)合帶保守序列(A/G)G309x(D/E)T312(T/S), 它們可能在蛋白質(zhì)的折疊、組裝中起關(guān)鍵作用[18,22]。這些結(jié)果表明, 本研究所克隆到的和序列是編碼中鏈烷烴羥化酶的基因序列, 是對應于擬南芥的2個垂直同源基因。

陸生植物地上大部分器官都有角質(zhì)層蠟質(zhì)覆蓋, 蠟質(zhì)是植物功能器官的重要結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果表明,與基因主要在甘藍型油菜莖、葉、花、角果中表達, 其中在葉片中的表達量最高, 在根系中表達量很低(圖3)。這與角質(zhì)層蠟質(zhì)主要沉積在植物地上部分的特性相一致。和在無蠟質(zhì)材料莖、葉片中幾乎不表達, 暗示了蠟質(zhì)的減少與的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。與中雙11相比, NoWax材料葉角質(zhì)層蠟質(zhì)中包括酮類在內(nèi)的各組分含量以及蠟質(zhì)總量均顯著下降(圖4和圖5),而在蠟質(zhì)合成基因表達方面, 除外, 負責烷類合成的、負責一級醇合成的等的轉(zhuǎn)錄水平也都下調(diào)。由、、等基因各成員啟動子同時發(fā)生突變而導致這些蠟質(zhì)合成基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的可能性幾乎為零, 因此很有可能是調(diào)控蠟質(zhì)合成基因表達的上游信號基因發(fā)生改變, 進而抑制蠟質(zhì)合成基因表達。和可能活躍地參與了甘藍型油菜地上部分, 尤其是葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積。

數(shù)據(jù)柱上*與**分別表示在<0.05或<0.001水平上差異顯著。

Asterisk and double asterisks above data bars indicated significance at<0.05and<0.001, respectively according to Student’s-test.

角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積除受發(fā)育狀況的控制外, 還對水分、光強、寒冷、季節(jié)變化等環(huán)境信號響應[23]。擬南芥葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)在鹽、干旱脅迫以及施用外源ABA后增加[24], 而在黑暗中減少[25]。當玉米四葉期被低溫處理7 d時, 其第三片葉角質(zhì)層蠟含量減少29%[26]。進一步在分子水平上的研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥蠟質(zhì)合成基因、、在鹽、水分脅迫下轉(zhuǎn)錄水平上調(diào), 而在低溫與黑暗條件下轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)[27]。本實驗中, NaCl與干旱脅迫顯著誘導了和的表達水平上調(diào), 低溫脅迫則顯著下調(diào)了和的表達, 表明是甘藍型油菜響應逆境脅迫的蠟質(zhì)基因。

植物在遭受各種生物和非生物脅迫時, 體內(nèi)激素水平會發(fā)生變化以啟動和調(diào)節(jié)某些與逆境適應相關(guān)的生理生化過程來誘導抗(耐)逆性的形成。ABA、ETH、SA、JA都是與植物逆境脅迫相關(guān)的激素。本試驗表明, ABA、SA、MeJA以及ACC不同程度地誘導了和的轉(zhuǎn)錄上調(diào), 其中MeJA與ABA的誘導效果最顯著。前人研究報道, ABA可誘導獨行菜葉片中大于C26的脂肪族物質(zhì)含量的增加, 其耐旱性隨之增強, 這可能是由于ABA對蠟質(zhì)合成基因的誘導[28]。擬南芥在水分脅迫下, ABA通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子MYB96的表達而促進蠟質(zhì)合成基因、、與的表達, 最終促進角質(zhì)層蠟質(zhì)的積累[29]。這些結(jié)果表明, 植物激素作為信號分子可以調(diào)控蠟質(zhì)合成基因的表達從而影響蠟質(zhì)沉積, 最終影響植物對逆境脅迫的響應。本試驗中, 干旱脅迫與ABA極大地誘導了的表達上調(diào), 表明可能在響應水分脅迫中起主要作用。

4 結(jié)論

克隆了2個甘藍型油菜中鏈烷烴羥化酶基因和, 它們是對應于擬南芥/的垂直同源基因;與主要在甘藍型油菜地上部分組織器官中表達, 在葉片中的表達量最高, 在無蠟粉材料莖、葉片中幾乎不表達, 暗示蠟質(zhì)的減少與的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān),和可能活躍地參與甘藍型油菜地上部分, 尤其是葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積。與受SA、MeJA、ACC、ABA、NaCl及干旱脅迫誘導表達, 其中可能在水分脅迫響應中起主要作用。

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Cloning and Expression Analysis of Alkane Hydroxylase Genefrom

XU Yi**, PENG Yang**, LI Shuai, ZHAO Qiu-Ling, ZHANG Shuang-Juan, LI Jia-Na, and NI Yu*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

In wax biosynthesis, the mid-chain alkane hydroxylase (MAH) catalyzes the hydroxylation reaction from alkanes to secondary alcohols and further to corresponding ketones. In this study, usingP450-dependent enzyme CYP96A15/ MAH1 gene as a probe, the full-length coding sequences of twogenes,(GenBank accession number KT795344) and(GenBank accession number KT795345), were isolated bycloning and RT-PCR. The ORF lengths ofandwere 1491 bp, and no intron was included.andshared 92.4% and 90.9% of sequence identity at nucleotide and amino acid level, respectively. The predicted BnMAH1-1 and BnMAH1-2 protein contained 496 amino acid residues, with typical P450 protein family conserved domains P415xR417x, K helix (E359xxR362), C-terminal hemopexin-like domain (F436xxGxRxCxG445) and oxygen binding zone (A/G)G309x(D/E)T312(T/S). NCBI BlastN, multiple alignment of amino acid sequence, and phylogenetic analysis showed that they were most homologous toCYP96A15/MAH1. Real-time quantitative PCR showed thatandwere mainly expressed in stem, leaf, flower, and silique. The highest expression level was found in leaf and the lowest was in root, which was consistent with the wax deposition on aerial part of plant. The expression ofandwas barely detected in stem and leaf of wax deficient cultivar, suggesting that the reduced wax deposition is due to the down-regulation oftranscription. The expression ofandwas significantly induced by exogenous application of SA, MeJA, ACC, and ABA and exposure to NaCl and drought, among whichmay play a major role in response to water stress.

; Cuticular wax; Alkane hydroxylase

10.3724/SP.J.1006.2017.00640

本研究由重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(cstc2016jcyjA0170)和中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(XDJK2014B037)資助。

This study was supported by the Chongqing Basic and Advanced Research Project (cstc2016jcyjA0170) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2014B037).

(Corresponding author): 倪郁, E-mail: nmniyu@126.com**同等貢獻(Contributed equally to this work)

E-mail: 714979637@qq.com, 327825919@qq.com

(收稿日期): 2016-11-04; Accepted(接受日期): 2017-03-01; Published online(網(wǎng)絡出版日期): 2017-03-08.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170308.1709.002.html