崔光艷，付立霞，王柳富，魏文志

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

基于線粒體16SrRNA基因序列的長江下游重要水體脆弱象鼻溞群體遺傳結構分析

崔光艷，付立霞，王柳富，魏文志

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

為了解長江下游地區(qū)10個水體脆弱象鼻溞群體的遺傳結構，研究測定了脆弱象鼻溞(Bosminafatalis)線粒體16SrRNA基因序列，結果顯示，100個樣本中共有8個變異位點，定義了9個單倍型，單倍型多樣性(Hd=0.284)和核苷酸多樣性(Nd=0.000 76)均較低。AMOVA分子變異分析結果表明，脆弱象鼻溞遺傳分化主要來自群體內，占93.33%，群體間的變異低，占6.67%。Fst值統(tǒng)計檢驗表明，各水體之間遺傳分化不顯著。系統(tǒng)發(fā)育樹和中介網絡圖說明脆弱象鼻溞單倍型間關系較近，未形成明顯譜系地理格局。中性檢驗和錯配分布結果說明脆弱象鼻溞出現(xiàn)過群體擴張現(xiàn)象。

脆弱象鼻溞(Bosminafatalis)；長江下游；16SrRNA；群體遺傳結構

象鼻溞(Bosmina)分類上屬于節(jié)肢動物門，甲殼動物亞門、甲殼動物綱、雙甲目、象鼻溞科，主要分布在湖泊、河口敞水區(qū)、水庫中，是淡水生態(tài)系統(tǒng)中浮游甲殼動物優(yōu)勢種[1]。

我國一般把象鼻溞分為3類，即長額象鼻溞(B.longirostris)、脆弱象鼻溞(B.fatalis)、簡弧象鼻溞(B.coregoni)[2]。范鳳娟[3]從尾爪櫛刺的列數(shù)及COΙ和ITS標記基因得出我國西部地區(qū)為長額象鼻溞，海南和東部地區(qū)為脆弱象鼻溞。象鼻溞會根據(jù)捕食者或者其他環(huán)境因素的壓力誘導改變自身的形態(tài)特征，進而有利于在環(huán)境中生存[4-5]，不同水體環(huán)境中的象鼻溞表型差異較大，關于象鼻溞的分類還存在較大爭議。目前國內外關于象鼻溞研究主要集中在形態(tài)、生態(tài)環(huán)境、群落結構等方面[6-7]。線粒體DNA(mtDNA)具有進化速度快、母系遺傳及易擴增等優(yōu)點，已成為分子進化研究中的理想材料[8]，其中16SrRNA既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，已成為廣泛應用于水生動物群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進化分析研究的分子標記[9]。本實驗以線粒體16SrRNA基因為分子標記，采用DNA測序技術對長江下游地區(qū)多個重要水體脆弱象鼻溞地理群體的16SrRNA基因序列進行測定，探討長江下游地區(qū)脆弱象鼻溞的群體遺傳結構，為揭示不同群體的系統(tǒng)發(fā)育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2014年5月初對長江下游地區(qū)的10個湖泊和水庫進行了樣本的采集(圖1)。分別是駱馬湖(LMH)，洪澤湖(HZH)，寶應湖(BYH)，高郵湖(GYH)，邵伯湖(SBH)，滆湖(GH)，太湖(TH)，巢湖(CH)，河王壩水庫(HWB)和棗林水庫(ZL)。采樣時用13號浮游生物網采集水中的浮游動物，將浮游動物轉移到采樣瓶中，無水乙醇固定。

圖1 采樣地點圖Fig.1 A map of the sampling locations

1.2 DNA的提取，擴增及序列測定

顯微鏡下挑選單個脆弱象鼻溞，蛋白酶K法消化，提取基因組DNA，具體方法為單個脆弱象鼻溞加入60 μL的蛋白酶K緩沖液(10 mmol/L Tris/HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，0.005%(v/v)NP-40，0.005%(v/v)Tween 20，加入蛋白酶K使其終濃度為0.1 mg/mL)，然后55 ℃在水浴鍋中過夜，取出后置于95 ℃水浴鍋中將蛋白酶K滅活15 min，保存于-20 ℃。16SrRNA引物[10]為16Sar-L (5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC ATC-3′)，16Sbr-H(5′- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)。PCR反應的總體積為30 μL，反應體系包括：Extaq(Takara) 15 μL，引物各1.5 μL，DNA模板3 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。最終成功測序的樣本數(shù)為LMH 5個，HZH 11個，BYH 10個，GYH 10個，SBH 11個，GH 12個，TH 10個，CH 13個，HWB 6個，ZL 12個。

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)分析

采用軟件Clustal X對序列進行校正比對，用Dna SP v5計算所得序列的堿基組成、保守位點、變異位點、簡約信息位點、單一突變位點。計算單倍型數(shù)目(h)，單倍型多樣性(Hd)，核苷酸多樣性(Nd)，繪制群體錯配分布圖。用Arlequin3.5.1.2軟件中的分子變異分析方法(AMOVA)計算群體間、群體內的遺傳分化Fst值，利用Tajima′sD，F(xiàn)u′sFs中性檢驗和錯配分布來推斷是否發(fā)生過群體擴張。采用MEGA 5.0對序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)Kimura 2- Parameter選用鄰接法(NJ)構建象鼻溞分子系統(tǒng)進化樹，進化樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap) 重復檢測1 000次。采用Network 4.6程序構建群體內所有單倍型的中介網絡圖。

2 結果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

本研究共獲得100條序列，有3個堿基的缺失和插入，其中保守位點456個，變異位點8個(表1)，變異百分率為1.71%。突變總數(shù)為8個，其中簡約信息位點3個，單一變異位點5個，所測序列中16SrRNA基因堿基組成為：A 35.2%，T 33.8%，C 11.6%和G 19.4%，A+T 含量為69.0%，G+C 含量為31.0%，表現(xiàn)出明顯的堿基A/T偏倚性，符合無脊椎動物線粒體基因序列堿基組成特點[11]。

2.2 群體遺傳結構

100條16SrRNA基因序列檢測出9種單倍型，分別命名H1-H9。對各群體序列進行多樣性分析表明，單倍型H2出現(xiàn)頻率最高為85.0% (85/100)，且被10個地理群體所分享，其次是單倍型H3出現(xiàn)的頻率最高，為4.0% (4/100)，為2個地理群體所共有，其他單倍型為私有單倍型(表1)。

根據(jù)DnaSP5.0軟件分析結果表明，總群體單倍型多樣性為0.284，核苷酸多樣性為0.000 76。不同地理群體的單倍型多樣性在0.000～0.500之間，核苷酸多樣性在0.000 00～0.001 92之間，其中駱馬湖單倍型多樣性最高(Hd = 0.500±0.265)，邵伯湖核苷酸多樣性最高(Nd = 0.001 92 ± 0.000 95)。

表1 不同地理群體脆弱象鼻溞16SrRNA基因遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of 16SrRNA among different geographic populations of B.fatalis

2.3 遺傳分化分析

應用Arlequin3.5.1.2軟件進行AMOVA分子變異分析表明(表2)，10個地理群體間遺傳分化變異較小(Fst=0.066 7，P=0.02)。群體間方差組分為0.014 5，占方差比率的6.67%，而群體內部的方差組分為0.203 2，占方差比率的93.33%，群體內的遺傳變異大于群體間的遺傳變異，說明象鼻溞的群體遺傳分化主要來自群體內，而不是群體間。通過計算兩兩群體間Fst值得到的結果顯示，各水體之間差異不顯著(表3)。

表2 脆弱象鼻溞10個群體16SrRNA基因的分子變異分析Tab.2 Analysis of molecular variance (AMOVA) of 16SrRNA gene in 10 geographic populations of B.fatalis

表3 脆弱象鼻溞不同群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值Tab.3 Fst between pairwise populations of B.fatalis

注：下三角為Fst值，上三角為P值

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取頸溝基合溞(Bosminopsisdeitersi)16SrRNA基因序列(GenBank登錄號：AF484022.1)作為外群，再選取Genebank中已報道的象鼻溞21個參考序列與本實驗的9個象鼻溞16SrRNA基因單倍型進行構建。結果顯示，本研究獲得的9個單倍型處于平行地位，都與脆弱象鼻溞聚在一起，并且本研究全部單倍型與其他象鼻溞序列分開，說明本研究的象鼻溞為脆弱象鼻溞。H2為各個水體的共享單倍型，聚類樹內各節(jié)點支持率較低，說明各單倍型之間關系較近。總體看來，系統(tǒng)發(fā)育樹并未反映出與地理位置相關的信息，未形成明顯的系統(tǒng)地理結構(圖2)。

單倍型網絡圖能進一步說明各單倍型之間的關系，利用Network 4.6程序構建單倍型網絡圖(圖3)，根據(jù)結果可知，單倍型的分布與系統(tǒng)發(fā)育樹結果吻合(圖2)。各群體的私有單倍型與共享單倍型關系密切，大多數(shù)單倍型以H2為中心呈“星狀”分布，表明H2在地理范圍上分布最廣泛，各地理群體間不存在明顯的分化關系。

2.5 群體歷史分析

Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測可以用來推測群體在發(fā)展過程中是否經歷過群體擴張。對10個群體進行中性檢驗，檢測結果均不顯著(P>0.10)，將所有個體作為一個整體進行分析，總群體Tajima′sD值為-1.975 35(P<0.10)，F(xiàn)u′sFs值為-8.067 87(P<0.10)，均為負值，并且統(tǒng)計檢驗均達顯著水平，錯配分布圖呈現(xiàn)單峰分布，說明脆弱象鼻溞群體經歷過群體擴張(圖4)。

圖2 基于16SrRNA基因的NJ系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16SrRNA gene sequences using NJ algorithm 分支上的數(shù)字為Bootstrap值

圖3 16SrRNA基因單倍型的中介網絡圖Fig.3 Median-joining haplotype network ofB.fatalis based on 16SrRNA gene 圓面積代表單倍型出現(xiàn)頻率，扇形面積代表 各樣品群體在同一單倍型中所占的比例。

圖4 脆弱象鼻溞不同群體的錯配分布圖Fig.4 Mismatch distributions of B.fatalis

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性形成的基礎，一般而言，物種遺傳多樣性的高低與其適應環(huán)境的能力以及進化潛力密切相關。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的兩個重要指標。本實驗中，脆弱象鼻溞單倍型多樣性為0.284±0.067，核苷酸多樣性為0.000 76±0.000 20，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性[12]。象鼻溞以孤雌生殖為主[13]，不同個體之間基因交流較困難；河王壩水庫、棗林水庫等為新中國成立后攔壩蓄水而形成，僅具有較短的擴張歷史，尚未積累較多的遺傳變異；各樣點湖泊位于長江下游，氣候條件和水體環(huán)境因子差異不大，對脆弱象鼻溞構成的選擇壓力不大，因此脆弱象鼻溞群體間的遺傳分化較小。

生物地理群體之間基因流的阻隔和環(huán)境因子之間的差異可導致不同群體之間遺傳結構的顯著差異，遺傳分化系數(shù)(Fst)是表觀群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)[14]，本研究中，AMOVA分析結果顯示，脆弱象鼻溞群體內遺傳變異占93.33%，群體間遺傳變異占6.67%，說明脆弱象鼻溞的遺傳分化不是地理隔離形成，而是群體內部個體間的變異造成的。Fst值越大，群體間分化程度越高，F(xiàn)st=0～0.05時為無分化，0.05～0.15為分化較小，0.15～0.25為中等分化，F(xiàn)st>0.25，群體間分化明顯[15]。10個地理群體間脆弱象鼻溞Fst為0.066 7，說明遺傳分化較小，兩兩群體間Fst值結果顯示，脆弱象鼻溞群體間不存在顯著的遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育分析和單倍型網絡圖均表明各群體間的遺傳差異不顯著，沒有形成明顯的系統(tǒng)地理結構。一般認為，水體中浮游動物通過水流、鳥、船等傳播交流頻繁[16-17]，象鼻溞也有同樣的特點。同時，本研究中脆弱象鼻溞分布的10個水體都是獨立的水體，但均通過長江及其支流相通，不同水體間，特別是河湖相通的水體間脆弱象鼻溞的基因可以相互交流，使不同群體基因交流的機會增加，沒有形成明顯的群體遺傳結構。

總群體Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測呈顯著負值，錯配分布圖呈現(xiàn)單峰型，說明脆弱象鼻溞群體在歷史進化過程中經歷過群體擴張。單倍型網絡圖呈星狀分布特征，分布格局也表明脆弱象鼻溞群體經歷過群體擴張現(xiàn)象。

通過對脆弱象鼻溞群體遺傳結構的分析，可以了解脆弱象鼻溞各分布地區(qū)的群體間關系和遺傳機制，今后可以采用更多的分子標記，擴大采樣范圍，以全面了解脆弱象鼻溞物種多樣性及分子地理學關系。

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(責任編輯：張瀟峮)

Genetic structure ofBosminafatalisbased on Mito 16SrRNA gene sequences in the water bodies along the lower reaches of the Yangtze River

CUI Guang-yan, FU Li-xia, WANG Liu-fu, WEI Wen-zhi

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,Jiangsu,China)

This study aims to investigate the genetic structure ofB.fatalisfrom 10 water bodies from the lower reaches of the Yangtze River.By using mitochondrial 16SrRNA, 100 individuals were sequenced and analyzed.The results showed that 8 variable sites were detected, and 9 haplotypes were defined based on the 16SrRNA sequences.It indicated a lower haplotype diversity (Hd=0.284)and nucleotide diversity (Nd=0.000 76) in these populations.Molecular variance analysis (AMOVA) demonstrated that most variation was explained by “within populations” (93.33%), and there is no significant variation among populations (6.67%).TheFstrevealed no significant difference among all water bodies.Haplotypes dispersed in different populations showed no obvious geographical structure in the phylogenetic tree and haplotype network.Neutrality and mismatch distribution test indicated that there was recent population expansion ofB.fatalisin spatial scales.

Bosminafatalis; the lower reaches of the Yangtze River; 16SrRNA; genetic structure

2016-12-23；

2017-03-06

國家自然科學基金項目(31200284)；江蘇省水產三新工程項目(Y2014-28)

崔光艷(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向為水產動物營養(yǎng)與生態(tài)。E-mail：cgy3247@163.com

魏文志。E-mail: wzwei@yzu.edu.cn

Q145

A

1000-6907-(2017)03-0003-06