葉曉春，邵水金，國(guó)海東，韓小晶，劉玉璞，陸萍萍

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電針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

葉曉春，邵水金，國(guó)海東，韓小晶，劉玉璞，陸萍萍

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

目的 觀察電針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷（SNI）大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的影響，探討其治療SNI的生物學(xué)機(jī)制。方法 選取成年雄性Wistar大鼠50只，分離并切斷大鼠坐骨神經(jīng)后于體式顯微鏡下將兩側(cè)斷端拉入神經(jīng)再生室內(nèi)造模。大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組。電針組進(jìn)行電針治療，連續(xù)28 d。治療結(jié)束后，HE染色觀察神經(jīng)再生，免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)組織和脊髓BDNF的表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清BDNF的表達(dá)。結(jié)果 電針組軸突再生數(shù)量明顯多于模型組，且大體輪廓較清晰；與模型組比較，電針組可促進(jìn)大鼠神經(jīng)組織、脊髓和血清BDNF的表達(dá)（＜0.01）。結(jié)論 電針可能通過上調(diào)神經(jīng)損傷后BDNF的表達(dá)，促進(jìn)大鼠SNI的再生修復(fù)。

電針；坐骨神經(jīng)損傷；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；軸突；大鼠

周圍神經(jīng)損傷（PNI）屬中醫(yī)學(xué)“傷筋”“痿證”范疇?！吨T病源候論?金瘡傷筋斷骨候》云：“夫金瘡始傷之時(shí)，半傷其筋，榮衛(wèi)不通，其瘡雖愈合后，仍令痹不仁也?！蹦壳爸委煼椒ㄓ猩窠?jīng)吻合技術(shù)、細(xì)胞移植及相關(guān)藥物應(yīng)用等，但神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不理想[1-2]。實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，電針在損傷神經(jīng)的功能恢復(fù)方面療效肯定和優(yōu)勢(shì)明顯，能明顯提高PNI患肢的肌力，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，減輕后遺癥[3-4]。本實(shí)驗(yàn)觀察電針治療后腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在各部位的變化及其對(duì)坐骨神經(jīng)損傷（SNI）大鼠BDNF的影響，探討電針治療SNI的生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每籠5只，人工光照時(shí)間為明暗交替12 h。

1.2 試劑

ELISA試劑盒（上海科夷生物科技有限公司），Anti-BDNF beta antibody（上海艾博抗貿(mào)易有限公司），TritonX-100（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（Jackson Immuno Research），DAPI染色液、抗熒光淬滅封片液（上海碧云天），OCT包埋劑（美國(guó)Thermo），Sucrose（美國(guó)Sigma）。

1.3 儀器

顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠），G6805A型電針治療儀（常州英迪），無菌針灸針0.25 mm×13 mm，Micro 17R高速微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)Fisher Scientific），超薄切片機(jī)（Leica，Switzerland），HM525冰凍切片機(jī)（Fisher Scientific），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS），超低溫冰箱（日本SANYO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

采用隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字將50只健康雄性大鼠分為正常組（12只）、假手術(shù)組（12只）、模型組（13只）、電針組（13只）。

2.2 造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，于右側(cè)大腿后外側(cè)切開皮膚，游離坐骨神經(jīng)約2 cm，用刀片切除約5 mm神經(jīng)，任其自行回縮后，再用12 mm長(zhǎng)的硅膠管將兩斷端各嵌入2 mm，形成8 mm長(zhǎng)的再生室[5]。肉眼直視下切除神經(jīng)，測(cè)量斷端嵌入的長(zhǎng)度，在體式顯微鏡下通過縫線將兩段固定，確定模型成功。

2.3 治療

電針組造模后第2日開始治療。治療中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠穴位圖譜[6]，于大鼠后肢髖關(guān)節(jié)后上緣取“環(huán)跳”，于膝關(guān)節(jié)下1.5 cm處取“足三里”，采用華佗牌0.25 mm×13 mm針灸針，針刺深度為0.6～1 cm，稍行提插捻轉(zhuǎn)手法。然后使用電針治療儀，正、負(fù)電極輸出線分別夾在“環(huán)跳”“足三里”上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波，頻率5 Hz，以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度。針刺過程中不對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉和捆綁，用自制固定器對(duì)大鼠進(jìn)行固定，每次20 min，每日1次，每周6次，共治療4周。正常組為未進(jìn)行造模的正常大鼠。假手術(shù)組具體操作與電針組相同，但不切斷坐骨神經(jīng)且不進(jìn)行任何治療。模型組造模后不進(jìn)行任何治療。

2.4 取材及處理

腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取出坐骨神經(jīng)、脊髓L4~5節(jié)段，分別置于4%多聚甲醛中固定，然后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖中脫水，OCT包埋后放入-80℃保存，冰凍切片機(jī)切片（厚度20 μm），用于免疫熒光檢測(cè)。部分坐骨神經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片（厚度4 μm），用于HE染色。血液采集：將大鼠麻醉后，于腹主動(dòng)脈，抽取5 mL血液，置于離心管中靜置2～3 h，待血凝后，3500 r/min離心10 min。由于部分樣品出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，選取血清分離成功的大鼠進(jìn)行ELISA檢測(cè)。取材完畢后，所有大鼠均斷頭處死。

2.5 HE染色

二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次浸泡1 h脫蠟。100%、95%、75%梯度乙醇水化。蒸餾水水洗3 min后，蘇木精染色5 min核染。蒸餾水洗3 min后，1%鹽酸乙醇分化30 s。蒸餾水洗，碳酸鋰飽和溶液返藍(lán)30 s，流水沖洗。5%伊紅染液染色1 min。95%、100%梯度乙醇脫水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明。中性樹膠滴入載玻片組織上封片。

2.6 免疫熒光檢測(cè)

取出損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)、脊髓L4~5切片，置于室溫干燥10 min，使組織充分貼在載玻片上。0.01 mol/L PBS浸泡5 min，去除包埋劑。室溫0.5% Triton-X-100破膜15 min，增加細(xì)胞膜通透性。0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。37 ℃烘箱內(nèi)封閉30 min，封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗anti-BDNF（1∶200），4 ℃冰箱過夜。次日取出，用含0.1%Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min。加入FITC/CY3標(biāo)記二抗IgG（1∶100～1∶500），37 ℃烘箱內(nèi)放置1 h。取出后用含0.1% Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次×10 min。室溫DAPI染色10 min，染核。0.01 mol/L PBS浸泡10 min。甘油封片，鏡下觀察并拍照。

2.7 ELISA檢測(cè)

取出損傷遠(yuǎn)端神經(jīng)、脊髓L4~5切片后室溫平衡20 min，于鋁箔袋中取出所需板條。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔（6個(gè)濃度）、樣本孔和空白對(duì)照孔。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備6只小試管，依次編碼，標(biāo)準(zhǔn)品1～6濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0 ng/mL。依照標(biāo)準(zhǔn)品順序分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中，空白對(duì)照孔加入50 μL蒸餾水，溫育并洗滌后于標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體50 μL。溫育并洗滌各孔，加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育10～15 min。加入終止液50 μL，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組BDNF濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±表示，組間比較采用方差分析，并用SNK法做兩兩比較。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HE染色結(jié)果

正常組和假手術(shù)組神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)較為緊密，神經(jīng)纖維排列規(guī)則，軸突較為粗大，髓鞘結(jié)構(gòu)清晰可見，間質(zhì)均勻淡染；模型組大鼠術(shù)側(cè)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)纖維排列紊亂，無規(guī)律可循，整體染色較淺，軸突腫脹如泡沫狀、崩解、脫髓鞘，單位視野內(nèi)正常形態(tài)的軸突數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少，軸突多不規(guī)則或模糊不清，較為細(xì)?。浑娽樈M軸突再生數(shù)量明顯多于模型組，且大體輪廓較為清晰，見圖1。

正常組假手術(shù)組 模型組電針組

4.2 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

在損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端，模型組血清BDNF表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組，電針組血清BDNF表達(dá)較模型組明顯上調(diào)，見圖2。脊髓L4~5節(jié)段模型組血清表達(dá)低于正常組和假手術(shù)組，電針組血清大鼠L4~5脊髓節(jié)段BDNF表達(dá)較模型組明顯上調(diào)，見圖3。

4.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

模型組大鼠血清BDNF含量明顯低于假手術(shù)組（＜0.01），電針組血清BDNF含量明顯高于模型組（＜0.01），見表1。

BDNFDAPIMerge 正常組 假手術(shù)組 模型組 電針組

BDNFDAPIMerge 正常組 假手術(shù)組 模型組 電針組

表1 各組大鼠血清BDNF含量比較（±s，ng/mL）

注：與假手術(shù)組比較，##＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

5 討論

中醫(yī)對(duì)外周神經(jīng)損傷及治療方法認(rèn)識(shí)較早，《內(nèi)經(jīng)》就提出“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的理論，“陽(yáng)明者，五臟六腑之海，主潤(rùn)宗筋，宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也”，在治療上注重整體觀，同時(shí)根據(jù)個(gè)體情況不同，辨證論治，辨其虛實(shí)，要求做到因時(shí)因地因人制宜。針刺被應(yīng)用于PNI臨床治療，其修復(fù)機(jī)制可能與PNI后修復(fù)過程中神經(jīng)元、軸突的再生以及微環(huán)境改變有關(guān)[7]。

環(huán)跳屬足少陽(yáng)膽經(jīng)之穴，是膽經(jīng)與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)交會(huì)穴，也是治療下肢痿痹的要穴；足三里屬足陽(yáng)明胃經(jīng)穴，為補(bǔ)益要穴。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度看，這2個(gè)穴的位置深部分別為坐骨神經(jīng)、腓深神經(jīng)和脛神經(jīng)的走行，電針刺激“環(huán)跳”“足三里”可直接作用于神經(jīng)局部，從而促進(jìn)血液循環(huán)、改善肌肉營(yíng)養(yǎng)等，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)?，F(xiàn)代研究表明，深刺“環(huán)跳”“足三里”能增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)Fos蛋白水平從而加速損傷神經(jīng)的修復(fù)，提高神經(jīng)干電活動(dòng)指數(shù)[8-9]。針刺上述腧穴后，分別在針柄上接通電針儀，電流調(diào)到接近人體本身生物電的微量電流，利用針和電2種刺激相結(jié)合，提高針刺治療效果。研究表明，在弱電場(chǎng)作用下，神經(jīng)元的突起向陰極方向生長(zhǎng)加快，向陽(yáng)極方向生長(zhǎng)則受到抑制[10]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其原理，將電針陽(yáng)極連接“環(huán)跳”而陰極連接“足三里”，有利于神經(jīng)從近心端向遠(yuǎn)心端的生長(zhǎng)。陳家澤等[11]研究認(rèn)為，低頻（5 Hz）電針治療對(duì)SNI大鼠肌肉萎縮有拮抗作用；另有實(shí)驗(yàn)表明，低頻電針（5 Hz）對(duì)神經(jīng)損傷后再生恢復(fù)作用優(yōu)于高頻電針（100 Hz）[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，最終選取斷續(xù)波、5 Hz低頻，治療中以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)，進(jìn)行大鼠SNI的治療，取得良好療效。HE染色發(fā)現(xiàn)電針組軸突再生數(shù)量明顯多于模型組，且大體輪廓較為清晰，表明電針對(duì)損傷模型大鼠神經(jīng)軸突的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTFs）家族中的一員，它是由德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Brade等在1982年從豬腦中分離出來的12.3 kD的小分子蛋白質(zhì)[13]。BDNF緩釋微球?qū)NI大鼠神經(jīng)有保護(hù)作用[14]。BDNF表達(dá)水平越高，大鼠SNI修復(fù)程度越高[15]。BDNF的作用機(jī)制可能是與其高親和力受體TrkB相結(jié)合，從而在神經(jīng)損傷后修復(fù)中發(fā)揮作用，BDNF特別對(duì)感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)有營(yíng)養(yǎng)作用。

有實(shí)驗(yàn)表明，脊髓挫傷后，損傷局部組織細(xì)胞中BDNF的表達(dá)升高，從而促進(jìn)受損脊髓神經(jīng)元功能恢復(fù)[16]。神經(jīng)損傷后，NTFs無法通過神經(jīng)逆轉(zhuǎn)到脊髓，故模型組脊髓中BDNF水平降低[17]。周圍神經(jīng)電刺激可促進(jìn)相應(yīng)脊髓節(jié)段及背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)BDNF[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠SNI后，脊髓L4~5節(jié)段BDNF表達(dá)下調(diào)，這可能與“細(xì)胞體-軸突-靶器官”軸中斷，導(dǎo)致NTFs不能沿著軸質(zhì)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元胞體有關(guān)，這也反映了神經(jīng)損傷后出現(xiàn)的退變。而與模型組比較，電針可促進(jìn)脊髓L4~5節(jié)段BDNF的表達(dá)，在一定程度上也反映了電針治療有利于神經(jīng)軸突的再生和恢復(fù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SNI后血清BDNF表達(dá)較假手術(shù)組降低，這與神經(jīng)組織中的表達(dá)情況相反。推測(cè)其原因可能為SNI后有更多的BDNF從血液運(yùn)輸?shù)讲∽兊纳窠?jīng)組織中，以促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)和再生，從而導(dǎo)致血清BDNF較假手術(shù)組降低。而電針治療不僅可以提高神經(jīng)組織BDNF的表達(dá)，還能影響全身BDNF的水平，使血清BDNF水平明顯升高，從而加快神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生。

綜上，電針組較模型組在損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端、脊髓L4~5節(jié)段和血清BDNF的表達(dá)均上調(diào)，推斷電針可能通過調(diào)控BDNF的表達(dá)對(duì)大鼠SNI功能的恢復(fù)起到一定的促進(jìn)作用。

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Effects of Electroacupuncture on Brain Derived Neurotrophic Factor of Rats with Sciatic Nerve Injury

YE Xiao-chun, SHAO Shui-jin, GUO Hai-dong, HAN Xiao-jing, LIU Yu-pu, LU Ping-ping

Objective To explore the effects of electroacupuncture on brain derived neurotrophic factor (BDNF) of rats with sciatic nerve injury (SNI); To discuss its biological mechanism for treatment of SNI. MethodsFifty adult male Wistar rats were chosen, and the sciatic nerves of rats were cut off and pulled on both sides of the cut ends into nerve regeneration chamber. The rats wererandomly divided into normal group,sham-operation group, model group, and electroacupuncture group. In the electroacupuncture group, the rats were treated by electroacupuncture for 28 days. After the treatment, the nerve regeneration was observed through HE staining. Immunofluorescence was used to analyze the expression changes of BDNF in the nerve tissue and spinal cord. ELISA was used to observe the changes of expression of serum BDNF. ResultsThe amount of axon regeneration in the electroacupuncture group was obviously more than that in the model group, and the outline of the tissue more clear. Electroacupuncture could promote the expression of BDNF in the nerve, spinal cord and serum of SNI ofrats compared with model group (<0.01). ConclusionElectroacupuncture can promote the repairment and regeneration of SNI in ratsby upregulating the expression of BDNF.

electroacupuncture; sciatic nerve; brain derived neurotrophic factor; axon; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.015

R245

A

1005-5304(2017)06-0060-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373754）

邵水金，E-mail：shaoshuijin@163.com

（2016-07-13）

（修回日期：2016-08-20；編輯：華強(qiáng)）