亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

        2017-05-24 08:39:05劉秋雨裴日周錢林林連增林
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2017年6期
        關(guān)鍵詞:劃痕細(xì)胞周期乳腺癌

        劉秋雨,裴日周,錢林林,連增林

        ?

        六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

        劉秋雨1,裴日周2,錢林林2,連增林3

        1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.天地散生物醫(yī)藥科技開發(fā)(北京)有限公司,北京 100080; 3.北京亦創(chuàng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院生物中藥研究所,北京 101111

        目的 觀察六氧化四砷(As4O6)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,探討其作用機制。方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,不同濃度As4O6對細(xì)胞進行干預(yù)。MTT法檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力,半定量RT-PCR檢測細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、細(xì)胞周期蛋白A2(Cyclin A2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p21和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA表達情況。結(jié)果 As4O6對MCF-7細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,且呈劑量依賴性(<0.01);與對照組(0 μmol/L)比較,As4O6濃度為9、12、15 μmol/L時,MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加(<0.05,<0.01);As4O6高(3 μmol/L)、低(1 μmol/L)濃度均可有效抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力(<0.01);隨As4O6濃度增加,Cyclin E1、Caspase-3、p21 mRNA表達明顯升高,Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達明顯降低(<0.05,<0.01)。結(jié)論 As4O6對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、周期、侵襲及遷移能力有明顯抑制作用,其機制可能與增強Cyclin E1、Caspase-3、p21及抑制Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達有關(guān)。

        六氧化四砷;乳腺癌細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖;侵襲;遷移;細(xì)胞周期

        砷劑是古老的抗腫瘤藥物,以常見的氧化劑和硫化劑等形式存在?!侗静菥V目》載:“砒石又名信石、砒霜,可治爛肉、蝕瘀及腐瘰?!彪m然砷劑被沿用至今,但其毒性限制了其適用范圍。三氧化二砷(As2O3)是最廣為熟知的砷劑,臨床用于急性早幼粒細(xì)胞白血病及多種腫瘤的治療。六氧化四砷(As4O6)對子宮頸癌細(xì)胞[1]、人胃癌細(xì)胞[2]、上皮癌細(xì)胞[3]等均有一定抑制作用,但其對乳腺癌的干預(yù)研究鮮有報道。因此,本研究觀察不同濃度As4O6對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡、周期和侵襲、遷移能力的影響,為As4O6干預(yù)乳腺癌的分子作用機制提供依據(jù)。

        1 實驗材料

        1.1 細(xì)胞

        人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

        1.2 藥物及制備

        As4O6,純度99.99%,韓國Chonjisan Co., Ltd.公司。稱取一定量As4O6溶解于水中,配制成5 mmol/L母液,過濾,室溫保存?zhèn)溆?,臨用時以培養(yǎng)基稀釋至不同濃度。

        1.3 主要試劑與儀器

        胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)液,Hyclone公司。MTT(Amresco)、二甲基亞砜(DMSO,Amresco)、青鏈霉素混合液(Solarbio)、RT-PCR試劑盒和Trizol,日本TaKaRa公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司,引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計合成。FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司),YT-CJ-2ND型超凈工作臺(北京亞泰),MCO-175 CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO),BDS200倒置相差顯微鏡(奧特光學(xué)),MULTLSKAN MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司),BIOMATE型紫外可見分光光度計(美國Thermo公司),GE4852型PCR儀(杭州柏恒科技有限公司),Champ Gel 5000型全自動凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

        2 實驗方法

        2.1 MTT法檢測MCF-7細(xì)胞增殖

        取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株,0.25%胰酶消化后,用含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋成2.5×104個/mL細(xì)胞懸液,以200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置空白孔、調(diào)零孔和As4O6給藥孔。As4O6給藥濃度分別為4、8、16、32、64 μmol/L,200 μL/孔,每組設(shè)6個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL,于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加100 μL DMSO,室溫振蕩15 min。待沉淀完全溶解后,于酶標(biāo)儀570 nm處測定光密度(OD)。計算細(xì)胞存活率(實驗組OD值÷對照組OD值×100%)。

        2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞凋亡

        取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后加入含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液(0、1、3、6、9、12、15 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集所有細(xì)胞,嚴(yán)格按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行操作,流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞凋亡。

        2.3 劃痕愈合實驗檢測MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力

        收集對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞,以2.5×105個/mL密度接種于6孔板中,2 mL/孔,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞長滿培養(yǎng)板后,吸棄上清液,用10 μL吸頭在6孔板上劃“一”字,PBS輕輕沖洗2次。每孔分別加入不含F(xiàn)BS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液(0、1、3 μmol/L),各設(shè)3個復(fù)孔,100倍倒置顯微鏡下,分別于藥物作用0、24、48 h拍照。計算劃痕愈合率[(0 h劃痕面積-24/48 h劃痕面積)÷0 h劃痕面積×100%]。

        2.4 RT-PCR檢測細(xì)胞周期、凋亡及遷移相關(guān)基因的表達

        采用Trizol兩步法提取MCF-7細(xì)胞內(nèi)的總RNA,測定OD260/OD280值。按TaKaRa RT-PCR試劑盒說明合成cDNA第一鏈,以此cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR退火溫度及循環(huán)數(shù):β-actin為58 ℃、30循環(huán),p21為60.5 ℃、40循環(huán),細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)為58 ℃、30循環(huán),細(xì)胞周期蛋白A2(Cyclin A2)為57.7 ℃、40循環(huán),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)為60.5 ℃、45循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見表1。

        表1 基因引物序列

        3 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析,實驗數(shù)據(jù)以±表示,多組間比較采用方差分析。<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        4 結(jié)果

        4.1 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        MTT法結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度As4O6干預(yù)后,MCF-7細(xì)胞生長受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。隨As4O6濃度增加,MCF-7細(xì)胞存活率逐漸降低,呈劑量依賴性,見圖1。

        注:與0 μmol/L比較,**P<0.01

        4.2 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

        流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了不同濃度As4O6對MCF-7細(xì)胞的凋亡作用,Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)檢測顯示,細(xì)胞機械損傷程度非常小,細(xì)胞因機械損傷的數(shù)目很少(<1%)。當(dāng)As4O6濃度為1、3、6 μmol/L時,細(xì)胞凋亡率均<10%,與對照組(0 μmol/L)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)。因此,在0~3 μmol/L間選擇適當(dāng)濃度,研究As4O6對MCF-7細(xì)胞遷移侵襲作用的影響。隨As4O6濃度增加(9、12、15 μmol/L),細(xì)胞凋亡率升高,與0 μmol/L比較,細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05,<0.01)。結(jié)果見圖2。

        4.3 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

        與0 μmol/L比較,低濃度(1 μmol/L)和高濃度(3 μmol/L)As4O6對MCF-7細(xì)胞的遷移能力均有明顯抑制作用(<0.01),隨As4O6濃度增加,抑制作用明顯增強,呈劑量依賴性,見圖3。

        4.4 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因表達的影響

        瓊脂糖凝膠電泳法檢測凋亡(Caspase-3、p21)和周期(Cyclin A2、Cyclin E1)相關(guān)基因表達情況。結(jié)果表明,As4O6作用于MCF-7細(xì)胞24 h后,隨As4O6給藥濃度增加,Cyclin E1、p21 mRNA表達呈升高趨勢,Cyclin A2 mRNA表達呈遞減趨勢,呈劑量依賴性;在As4O6高濃度(15 μmol/L)時,Caspase-3、p21、Cyclin A2、Cyclin E1 mRNA表達水平與0 μmol/L比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01),見圖4。

        As4O6 0 μmol/L As4O6 1 μmol/L As4O6 3 μmol/L As4O6 6 μmol/L As4O6 9 μmol/L As4O6 12 μmol/L As4O6 15 μmol/L

        0 μmol/L1 μmol/L3 μmol/L 0 h 24 h 48 h

        As4O6/(μmol/L) 0 3 6 9 12 15 Caspase-3596 bp β-actin206 bp p21426 bp β-actin206 bp Cyclin A2382 bp β-actin206 bp Cyclin E1305 bp β-actin206 bp

        注:與0 μmol/L比較,*<0.05,**<0.01

        圖4 As4O6對乳腺癌MCF-7細(xì)胞Caspase-3、p21、 Cyclin A2、Cyclin E1基因表達的影響

        4.5 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達的影響

        MMP-9與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),其mRNA表達隨As4O6濃度增加而逐漸降低。高濃度(15 μmol/L)As4O6與0 μmol/L比較,MMP-9 mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01),見圖5。

        As4O6/(μmol/L) 0 3 6 9 12 15 MMP-9154 bp β-actin206 bp

        5 討論

        研究表明,As4O6可通過引起腫瘤細(xì)胞凋亡[4]、抑制腫瘤血管新生[5]、增加實體腫瘤對放射的敏感性[6]等多種方式發(fā)揮抗腫瘤藥效作用。但其對乳腺癌的作用機制尚不明確,而乳腺癌在全球女性癌癥患病率排名居首,迫切需要有效的治療藥物。因此,研究As4O6治療乳腺癌的作用機制十分必要。

        細(xì)胞凋亡和周期是衡量腫瘤細(xì)胞的重要指標(biāo),細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的失衡也可導(dǎo)致腫瘤生成。本研究結(jié)果表明,As4O6對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用明顯,并隨As4O6濃度增加而增強,當(dāng)濃度達到64 μmol/L時,細(xì)胞存活率<50%。當(dāng)濃度為9、12、15 μmol/L時,作用于MCF-7細(xì)胞24 h可明顯引起凋亡。Caspase-3和p21是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的2種基因,正常情況下細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3無活性,以酶原形式存在,當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時,它被一系列反應(yīng)激活后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。同時,p21基因的過表達可促進細(xì)胞凋亡,并可使細(xì)胞周期阻滯于G1、G2或S期。而本研究結(jié)果表明,隨As4O6濃度增加,Caspase-3和p21均呈增加趨勢,且流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,MCF-7細(xì)胞凋亡情況與上述特點相符,提示As4O6可通過促進MCF-7細(xì)胞凋亡途徑達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖目的。為進一步明確As4O6對MCF-7細(xì)胞的作用機制,本研究檢測了細(xì)胞周期相關(guān)基因(Cyclin A2和Cyclin E1)的表達情況。Cyclin A2為一種細(xì)胞周期的正向調(diào)節(jié)蛋白,可與細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK1和CDK2)形成復(fù)合物,在細(xì)胞周期G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)節(jié)DNA合成和促進細(xì)胞有絲分裂的雙重作用,同時,Cyclin E1是G1期重要的調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白,促進細(xì)胞周期的G1/S移行過程,并且是移行過程中的主要限速因子,一旦Cyclin E1基因擴增或表達失控則可能誘發(fā)腫瘤[8-10]。本研究結(jié)果表明,As4O6可抑制Cyclin A2基因的表達,經(jīng)As4O6干預(yù)后,MCF-7細(xì)胞Cyclin A2表達顯著降低,表明As4O6可以通過干預(yù)細(xì)胞周期達到治療目的。而Cyclin E1與Cyclin A2的結(jié)果相反,As4O6干預(yù)后,MCF-7細(xì)胞Cyclin E1表達顯著升高,這一現(xiàn)象可能與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。因此,更加明確了As4O6對MCF-7細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因的作用機制。

        乳腺癌是由乳房組織病變導(dǎo)致的癌癥,由于乳腺癌細(xì)胞喪失了正常細(xì)胞的特性,細(xì)胞之間的黏附能力下降,容易發(fā)生脫落,形成的游離癌細(xì)胞可隨血液或淋巴液散布周身,使乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。MMP-9是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的主要參與者。由于Ⅳ型膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的基本骨架,而MMP-9分泌的明膠酶可降解Ⅳ型膠原[11],因此MMP-9在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明,經(jīng)As4O6干預(yù)后,MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA表達呈降低趨勢,提示As4O6可通過抑制MMP-9基因的表達有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。進一步結(jié)合劃痕愈合實驗結(jié)果,表明As4O6可有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

        綜上所述,As4O6可通過干預(yù)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞阻滯、細(xì)胞侵襲及遷移能力等多途徑發(fā)揮藥效。As4O6可促進乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡,將其阻滯在S期,破壞腫瘤細(xì)胞DNA合成來抑制細(xì)胞增殖,其機制可能與p21、Caspase-3、Cyclin E1、Cyclin A2有關(guān)。此外,As4O6可通過抑制MMP-9分泌,阻止細(xì)胞基底膜降解,達到對MCF-7細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

        [1] KIM Y W, BAE S M, LEE K H, et al. Retraction:comparison of As2O3and As4O6in the detection of SiHa cervical cancer cell growth inhibition pathway[J]. Cancer Res Treat,2007,39(1):47.

        [2] CHUNG W H, KOO H J, KUH H J, et al. Anti-proliferative effect of tetra-arsenic oxide (TetraAs) in human gastric cancer cells in vitro[J]. Kor Pharm Sci,2007,37(5):305-309.

        [3] WOO S H, PARK M J, AN S, et al. Diarsenic and tetraarsenic oxide inhibit cell cycle progression and bFGF- and VEGF-induced proliferation of human endothelial cells[J]. J Cell Biochem, 2005,95(1):120-130.

        [4] PARK I C, PARK M J, WOO S H, et al. Tetraarsenic oxide induces apoptosis in U937 leukemic cells through a reactive oxygen species-dependent pathway[J]. Int J Oncol,2003,23(4):943-948.

        [5] PARK M J, PARK I C, BAE I J, et al. Tetraarsenic oxide, a novel orally administrable angiogenesis inhibitor[J]. Int J Oncol, 2003,22(6):1271-1276.

        [6] PARK S G, JUNG J J, WON H J, et al. Tetra-arsenic oxide (Tetras) enhances radiation sensitivity of solid tumors by anti-vascular effect[J]. Cancer Lett,2009,277(2):212-217.

        [7] ZHANG Y, GOODYER C, LEBLANC A. Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjection with active caspase-3,-6,-7 and -8[J]. J Neurosci,2000,20(22):8384-8389.

        [8] LI H P, JI J F, HOU K Y, et al. Prediction of recurrence risk in early breast cancer using human epidermal growth factor 2 and cyclin A2[J]. Chin Med J (Engl),2010,123(4):431-437.

        [9] 吉愛軍,唐金海.乳腺癌術(shù)后患者Cyclin A1、A2、D1、E1表達及其臨床意義[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,30(9):1290-1294.

        [10] 王敏,李惠平,趙紅梅,等.Bcl-2、cyclin A2和PI3K在激素受體陰性乳腺癌中的表達及意義[J].中國微創(chuàng)外科雜志,2013,13(8):713-723.

        [11] ARVELO F, COTTE C. Metalloproteinases in tumor progression[J]. Invest Clin,2006,47(2):185-205.

        Effects of Tetra-arsenic Oxide on Proliferation, Migration and Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells

        LIU Qiu-yu1, PEI Ri-zhou2, QIAN Lin-lin2, LIAN Zeng-lin3

        Objective To observe the effects of tetra-atsenic oxide (As4O6) on the proliferation, migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells; To explore its potential mechanism. Methods The human breast cancer MCF-7 cells were regarded as the research object and cultured in vitro, with different concentrations of As4O6using to intervene in MCF-7 cells. The cell proliferation was detected by MTT assay; the flow cytometry and wound-healing assay were used to detect the cell apoptosis and migration, respectively. The expressions of Cyclin E1, Cyclin A2, Caspase 3, p21 and MMP-9 mRNA were accessed by semi quantitative RT-PCR. Results As4O6had a significant inhibitory effect on the proliferation of MCF-7 cells in a dose dependent manner. Compared with the control group (0 μmol/L), the apoptosis rate increased significantly when the concentration of As4O6was 9, 12, 15 μmol/L (<0.01). Either As4O6at high (3 μmol/L) or low (1 μmol/L) concentration could effectively inhibit the migration of MCF-7 cells (<0.01). With the increasing concentration of As4O6, the expressions of Cyclin E1, Caspase 3, and p21 mRNA significantly increased, while the expressions of Cyclin A2 and MMP-9 mRNA significantly decreased (<0.05,<0.01). Conclusion As4O6can significantly inhibit the proliferation, cycle, invasion and migration of breast cancer MCF-7 cells, and the mechanism may be related to the increase of expressions of cyclin E1, caspase 3, p21 and inhibition of expressions of cyclin A2 and MMP-9.

        tetra-arsenic oxide; breast cancer cells; cell apoptosis; cell proliferation; invasion; migration; cell cycle

        10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.011

        R285.5

        A

        1005-5304(2017)06-0044-05

        連增林,E-mail:zenglinlian@aliyun.com

        (2016-12-09)

        (修回日期:2016-12-19;編輯:向宇雁)

        猜你喜歡
        劃痕細(xì)胞周期乳腺癌
        絕經(jīng)了,是否就離乳腺癌越來越遠呢?
        中老年保健(2022年6期)2022-08-19 01:41:48
        富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
        乳腺癌是吃出來的嗎
        紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
        胸大更容易得乳腺癌嗎
        別逗了,乳腺癌可不分男女老少!
        祝您健康(2018年5期)2018-05-16 17:10:16
        冰上芭蕾等
        犀利的眼神
        NSCLC survivin表達特點及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
        X線照射劑量率對A549肺癌細(xì)胞周期的影響
        癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:43
        国产精品女人呻吟在线观看| 亚洲av熟女天堂久久天堂| 中文字幕国产亚洲一区| 人妻丰满熟妇岳av无码区hd| 色噜噜狠狠色综合成人网| 亚洲精品成人网线在线播放va| 日韩人妻美乳中文字幕在线| 亚洲 日韩 激情 无码 中出| 国产成人无码一区二区三区在线 | 肉体裸交137日本大胆摄影| 婷婷四房播播| 中文字幕日韩人妻在线| 亚洲午夜精品一区二区麻豆av| 少妇下面好紧好多水真爽播放| 国产欧美乱夫不卡无乱码| 蜜桃在线一区二区三区| 欲女在线一区二区三区| 蜜臀av性久久久久蜜臀aⅴ| 中文字幕在线日韩| 蜜桃码一区二区三区在线观看| www国产亚洲精品久久麻豆| 精品无码人妻一区二区三区| 欧美日韩国产高清| 一区二区视频在线国产| 毛片免费视频在线观看| 欧美视频在线观看一区二区| 一区二区日本影院在线观看| 国产一区二区三区在线综合视频| 久久夜色精品国产欧美乱| 日本a在线免费观看| 日本一区二区三区精品免费| 无码人妻精品一区二区三区9厂 | 风韵丰满熟妇啪啪区老老熟妇 | 91精品视品在线播放| 亚洲大片一区二区三区四区| 精品卡一卡二乱码新区| 蜜桃成人无码区免费视频网站| 亚洲va成无码人在线观看| 日本五十路人妻在线一区二区| 亚洲av无码国产精品色软件下戴| 91久久精品无码人妻系列|