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        栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞興奮性毒性損傷的影響

        2017-05-24 08:39:05張玉琴孫承韜李煌徐偉褚克丹林羽
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2017年6期
        關(guān)鍵詞:栝樓谷氨酸桂枝

        張玉琴,孫承韜,李煌,徐偉,褚克丹,林羽

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        栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞興奮性毒性損傷的影響

        張玉琴,孫承韜,李煌,徐偉,褚克丹,林羽

        福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建福州 350122

        目的 觀察栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)興奮性毒性損傷的影響,并初步探討其作用機制。方法 采用谷氨酸誘導(dǎo)PC12興奮性毒性損傷造模。將細胞隨機分為正常組、谷氨酸組和栝樓桂枝顆粒低(200 μg/mL)、中(400 μg/mL)、高(800 μg/mL)劑量組,MTT法和LDH法檢測PC12活力;Caspase-3活性檢測法、Annexine V/PI雙染色法檢測細胞凋亡,Western blot和RT-PCR分別檢測Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表達。結(jié)果 與谷氨酸組比較,MTT法栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12活力升高,LDH法栝樓桂枝顆粒各劑量組細胞活力降低;Annexine V/PI雙染色法栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12凋亡率降低;Caspase-3活性檢測法栝樓桂枝顆粒各劑量組Caspase-3活性降低;RT-PCR及Western blot檢測栝樓桂枝顆粒各劑量組Bax表達降低、Bcl-2表達升高。結(jié)論 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)PC12興奮性毒性損傷有一定的保護作用,其保護作用與其抗細胞凋亡作用有關(guān)。

        栝樓桂枝顆粒;谷氨酸;腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞;細胞凋亡

        隨著世界老齡化的加劇,腦卒中成為發(fā)展中國家高致殘率、高死亡率、高發(fā)病率的一種疾病,給人類健康造成了巨大的威脅。栝樓桂枝顆粒(處方源于栝樓桂枝湯)為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑,臨床用于治療腦卒中后痙攣性偏癱。臨床觀察顯示,栝樓桂枝湯可明顯改善中風(fēng)后患者運動功能、痙攣狀態(tài)及日常生活活動能力[1]。體內(nèi)外研究也表明,栝樓桂枝湯具有抗氧化、抗炎及抗興奮性氨基酸毒性損傷的作用[2-7]。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上,采用谷氨酸誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)興奮性毒性損傷為模型,觀察其對模型大鼠的影響,并初步探討其作用機制,為臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

        1 實驗材料

        1.1 細胞

        高分化大鼠PC12,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所。

        1.2 藥物及制備

        栝樓桂枝顆粒,福建省第二人民醫(yī)院藥劑科提供,無菌條件下用含1%胎牛血清1640培養(yǎng)基配制成1 mg/mL的母液,使用時稀釋成不同濃度的工作液。

        1.3 主要試劑與儀器

        谷氨酸,Sigma公司;噻唑藍(MTT),Sigma公司;Annexin V/PI凋亡試劑盒,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)公司;Caspase-3 Assay Kit,Molecular Probes;兔抗大鼠Bcl-2、Bax和β-actin抗體,Cell Signalling公司;辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG,廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司;RevertAidTMFirst strand cDNA Synthsis Kit,F(xiàn)ermenta公司;Power SYBR?Green PCR Master Mix,Life Sciences公司。凝膠成像儀,美國伯樂公司;PCR擴增儀,美國伯樂公司;7900型熒光定量PCR儀,ABI公司。

        2 實驗方法

        2.1 細胞增殖檢測

        將對數(shù)期PC12接種至96孔板(2×104個/孔),將細胞隨機分為正常組、谷氨酸組和栝樓桂枝顆粒低、中、高劑量組,每組6孔,實驗重復(fù)3次。培養(yǎng)24 h后,栝樓桂枝顆粒低、中、高劑量組分別加入200、400、800 μg/mL栝樓桂枝顆粒藥液,24 h后加入谷氨酸(終濃度為15 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸棄培養(yǎng)上清液,每孔加100 μL DMSO溶解甲瓚結(jié)晶,室溫震搖5 min,完全溶解后,于酶標(biāo)儀570 nm處測定光密度(OD)。計算細胞存活率(實驗組OD值÷正常組OD值×100%)。

        2.2 細胞活力檢測

        分組、給藥方法同“2.1”項,24 h后加入谷氨酸(終濃度為15 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,取細胞上清液,LDH法檢測PC12活力,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。于波長450 nm處測定OD值,計算細胞活力。細胞活力(U/L)=(測定管OD值-對照管OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2 mmol/L)×1000。

        2.3 細胞凋亡檢測

        分組、給藥方法同“2.1”項,24 h后加入谷氨酸(終濃度為15 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,收集細胞,向細胞沉淀中加入Binding Buffer 500 μL,重懸細胞。混勻后,加入5 μL Annexin V-FITC,混合均勻,加入5 μL PI溶液,輕輕混合均勻,室溫下避光孵育15 min,1 h內(nèi)流式細胞儀分析細胞凋亡。

        2.4 Caspase-3活性檢測

        分組、給藥方法同“2.1”項,24 h后加入谷氨酸(終濃度為15 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,收集細胞,加入50 μL預(yù)冷的Cell Lysis Buffer,冰上孵育30 min,5000 r/min離心5 min,吸取上清液置于新的離心管,置于冰上待用,BCA法測定樣品蛋白含量。用Cell Lysis Buffer稀釋一定量的蛋白至50 μL,加入96孔板,再加入50 μL 2×底物工作液(含DTT 0.495 μmol,Z-DEVD-R110 0.012 5 μmol),室溫孵育30~60 min,待顏色發(fā)生明顯變化時,于酶標(biāo)儀波長405 nm處測定OD值。計算蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正后A值[(測定孔OD值-無酶孔OD值)×待測樣品蛋白濃度],以正常組Caspase-3活性為1,以每個樣本的校正A值除以正常組校正A值的商計算各組Caspase-3相對活性(處理組校正A值÷正常組校正A值)。

        2.5 Bax、Bcl-2 mRNA表達檢測

        2.5.1 總RNA提取 Trizol法提取總RNA,微量紫外分光光度計檢測A260、A280,取A260/A280在1.8~2.0樣品進行實驗,并計算總RNA濃度。

        2.5.2 實時PCR檢測 根據(jù)濃度計算2 μg樣本RNA體積,按照RevertAidTMFirst strand cDNA Synthsis Kit試劑盒說明書配制20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系。輕柔混勻,低速離心,于PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。各目的基因引物由上海生工生物工程有限公司合成,目的基因引物序列見表1。按照試劑盒配制20 μL的擴增體系:Power SYBR Green PCR Master Mix(2×)10 μL,引物各2 μL,cDNA 1 μL,Nuclease-free water 1 μL。Real-time PCR檢測以β-actin為內(nèi)參基因,計算谷氨酸組和給藥組相對于正常組目的基因的表達量,最終結(jié)果用相對表達量2-ΔΔct表示。

        2.6 Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

        采用Western blot檢測。用含1%PMSF的蛋白裂解液提取蛋白,并按BCA蛋白測定說明書對每組蛋白含量進行測定,樣品經(jīng)12%凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉,將膜與溶于封閉液中一抗4 ℃孵育過夜。將膜浸入二抗稀釋液,室溫孵浴1 h 洗滌,在暗室內(nèi)將ECL顯影液加到膜的蛋白面,靜置1 min,充分顯色后,曝光,凝膠成像儀顯影、拍照,應(yīng)用凝膠圖像分析軟件分析各目的蛋白相對表達量,β-actin為內(nèi)參基因,并計算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值。

        表1 基因引物序列

        3 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結(jié)果以±表示,組間比較用方差分析。<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        4 結(jié)果

        4.1 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12增殖的影響

        MTT法顯示,谷氨酸組較正常組PC12活力明顯下降(<0.05),栝樓桂枝顆粒高、中劑量組PC12活力較谷氨酸組明顯升高(<0.05),見圖1。LDH法顯示,谷氨酸組較正常組PC12活力明顯升高(<0.05),栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12活力較谷氨酸組變化不明顯,見圖2。

        4.2 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12凋亡的影響

        與正常組比較,谷氨酸組PC12凋亡率升高;與谷氨酸組比較,栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12凋亡率降低,見圖3。

        注:與正常組比較,#P<0.05;與谷氨酸組比較,*P<0.05

        注:與正常組比較,#P<0.05

        注:A.正常組;B.谷氨酸組;C.栝樓桂枝顆粒低劑量組; D.栝樓桂枝顆粒中劑量組;E.栝樓桂枝顆粒高劑量組

        4.3 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12 Caspase-3活性的影響

        與正常組比較,谷氨酸組PC12 Caspase-3活性明顯升高(<0.01);與谷氨酸組比較,栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Caspase-3活性明顯降低(<0.05)。結(jié)果見表2。

        表2 各組PC12 Caspase-3活性比較(±s,%)

        注:與正常組比較,##<0.01;與谷氨酸組比較,*<0.05

        4.4 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12 Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

        與正常組比較,谷氨酸組PC12 Bcl-2基因表達降低、Bax基因表達明顯升高(<0.05,<0.01);與谷氨酸組比較,栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Bax基因表達降低、Bcl-2基因表達升高,栝樓桂枝顆粒高劑量組差異明顯(<0.05)。結(jié)果見圖4。

        注:與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與谷氨酸組比較,*P<0.05

        4.5 栝樓桂枝顆粒對谷氨酸誘導(dǎo)損傷PC12 Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

        與正常組比較,谷氨酸組PC12 Bcl-2、Bax蛋白表達明顯降低(<0.01);與谷氨酸組比較,栝樓桂枝顆粒各劑量組PC12 Bax、Bcl-2蛋白表達增強,栝樓桂枝顆粒高劑量組差異明顯(<0.01)。結(jié)果見圖5。

        A B C D E BaxBcl-2β-actin23 kD28 kD43 kD

        注:A.正常組;B.谷氨酸組;C.栝樓桂枝顆粒低劑量組; D.栝樓桂枝顆粒中劑量組;E.栝樓桂枝顆粒高劑量組

        注:與正常組比較,##<0.01;與谷氨酸組比較,**<0.01

        圖5 各組PC12 Bcl-2、Bax蛋白表達比較(±,=6)

        5 討論

        栝樓桂枝顆粒處方來源于張仲景《金匱要略》,由天花粉、白芍、桂枝、甘草、生姜、大棗6味藥組成。方中天花粉清熱生津而潤燥養(yǎng)筋、舒緩筋脈;同時以桂枝湯為基礎(chǔ)方,剛?cè)嵯酀?,開闔相佐,發(fā)汗解肌、溫經(jīng)通脈、助陽化氣、散寒止痛。諸藥配伍,結(jié)構(gòu)嚴謹,邪正兼顧,陰陽并補,氣血雙調(diào),柔潤筋脈,緩痙之急,能夠解肌和營、生津柔筋,臨床用于治療腦卒中后痙攣性偏癱。

        腦卒中發(fā)生機制是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程,其中谷氨酸誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生興奮性或氧化應(yīng)激損傷的過程包括多種信號傳導(dǎo)途徑的參與,其機制比較復(fù)雜。研究表明,抗凋亡蛋白Bcl-2基因家族和Caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。Bcl-2是一種抗凋亡的基因,Bcl-2過度表達可有效降低神經(jīng)元的損傷,其原因可能與線粒體膜的穩(wěn)定與完整有關(guān)[9]。當(dāng)無凋亡因素存在時,它和Bax共同維持細胞膜的完整性,抑制線粒體凋亡。受到凋亡刺激時,Bcl-2與Bax生成二聚體釋放Bax,導(dǎo)致細胞凋亡。因此,Bcl-2/Bax比值對于細胞凋亡至關(guān)重要[10]。富蘇等[11]發(fā)現(xiàn)通絡(luò)化痰膠囊能下調(diào)缺血半暗帶Bax表達,促進Bcl-2表達,減少細胞凋亡水平,促進腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實驗通過Western Blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達,發(fā)現(xiàn)栝樓桂枝顆粒能上調(diào)Bcl-2的表達,提高Bcl-2/Bax比值,表明栝樓桂枝顆粒可起到抗凋亡的作用,且RT-PCR的結(jié)果進一步驗證了其抗凋亡作用。

        作為半胱氨酸蛋白酶家族中一員,Caspase-3在凋亡細胞死亡級聯(lián)過程中起著重要作用[12]。它是凋亡細胞通路中的下游蛋白,可以一定的氨基酸序列剪接成多種活性的關(guān)鍵蛋白,在哺乳動物細胞凋亡過程中起著重要作用[13]。無論是fas配體途徑活化Caspase-8,還是線粒體途徑過程中活化Caspase-9,都能導(dǎo)致Caspase-3激活,引起Caspase-3級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細胞凋亡[14]。體內(nèi)研究結(jié)果表明,高濃度谷氨酸能夠激活細胞內(nèi)Caspase-3蛋白的表達,參與谷氨酸誘導(dǎo)的PC12凋亡[15]。

        Caspase-3可以催化底物Z-DEVD-R110分解出R110,發(fā)出熒光,一旦Caspase-3發(fā)生剪切,就可以使無熒光的底物產(chǎn)生熒光,且Caspase-3的活性與熒光呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果表明,谷氨酸處理細胞后,Caspase-3相對活性顯著升高,表示細胞發(fā)生凋亡。而加入栝樓桂枝顆粒后,Caspase-3相對活性顯著降低,凋亡通路受到抑制,表明栝樓桂枝顆粒能抑制谷氨酸引起的細胞凋亡,起到一定的保護作用。

        綜上,栝樓桂枝顆粒能降低PC12 Caspase-3活性,提高Bcl-2/Bax比值,對谷氨酸誘導(dǎo)PC12損傷有保護作用,其機制可能與抗細胞凋亡有關(guān)。但這只是部分調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因研究,具體是否通過調(diào)節(jié)炎癥因子等其他途徑實現(xiàn)其保護作用,有待進一步研究其多層次、多基因的神經(jīng)保護作用。

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        EffectsofGranules on Excitatory Toxic Damage of PC12 Induced by Glutamate

        ZHANG Yu-qin, SUN Cheng-tao, LI Huang, XU Wei, CHU Ke-dan, LIN Yu

        Objective To investigate the effectsofGranules on excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate; To primarilyexplore the involved protective mechanism ofGranules. MethodsExcitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate was used to establish models. Cells were divided into normal group, glutamate group, andGranules low- (200 μg/mL), medium- (400 μg/mL) and high-dose (800 μg/mL) groups. MTT and LDH assay methods were used to detect PC12 activity; Caspase-3 activity detection method and Annexine V/PI double staining method were used to detect cell apoptosis; Western blot and RT-PCR were used to detect Bcl-2, Bax protein and mRNA expression. Results Compared with glutamate group, MTT showed that allGranules groups could improve PC12 activity, and LDH showed that cell activity in allGranules groups decreased; Annexine V/PI double staining method showed that allGranules groups could decrease the PC12 apoptosis; Caspase-3 activity detection method showed thatallGranules groups could decrease the activity of Caspase-3; Western blot and RT-PCRshowed that allGranules groups could reduce Bax expression and increase Bcl-2 expression.ConclusionGranuleshavecertainprotective effectson excitatory toxic damage of PC12 induced by glutamate, which may be related to its anti-apoptotic activity.

        Granules; glutamate; PC12; cell apoptosis

        10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.010

        R285.5

        A

        1005-5304(2017)06-0039-05

        國家自然科學(xué)基金(81674046);福建省教育廳新世紀(jì)人才項目(2015年)

        林羽,E-mail:yulam@fjtcm.edu.cn

        (2016-09-19)

        (修回日期:2016-10-13;編輯:華強)

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