郇 蕾,王旭旭,劉文海,李 玲,2,高東升,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,山東 泰安 271018

2.作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安 271018

3.濰坊工程職業(yè)學院,山東 濰坊 261000

油桃花芽自然休眠誘導期FAR1/FHY3基因的表達分析

郇 蕾1,王旭旭1,劉文海3,李 玲1,2,高東升1,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,山東 泰安 271018

2.作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安 271018

3.濰坊工程職業(yè)學院,山東 濰坊 261000

FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3(FHY3)和它的同源基因FAR-RED-IMPAIREDRESPONSE 1(FAR1)參與遠紅光、脫落酸（Abscisic acid，ABA）對擬南芥種子休眠的調(diào)節(jié)，然而FHY3/FAR1在木本植物花芽休眠中的表達尚不清楚。本研究以八年生‘中油四號’油桃花芽為材料，利用NCBI找出桃樹上的FAR1/FHY3同源基因，測定了同源性最高的5個基因在休眠誘導期的表達，并在休眠誘導期分別用脫落酸及遠紅光處理桃樹，熒光定量檢測了基因的表達量變化。結(jié)果表明，桃中同源性最高的Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000 4個基因在休眠誘導期均有上調(diào)，且受ABA誘導表達上調(diào)，受遠紅光誘導表達下調(diào)，而Prupe.2G327900在休眠誘導期表達下調(diào)，受ABA誘導下調(diào)，受遠紅光誘導上調(diào)。我們推測，PpFRSs基因可能通過不同的模式參與油桃花芽休眠誘導的調(diào)控。

ABA;花芽休眠誘導;表達分析;遠紅光;FHY3/FAR1

光是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境信號。高等植物在不斷進化的過程中，形成了一個光感受器的網(wǎng)絡(luò)來感受光環(huán)境的變化，適應環(huán)境，影響自身生長發(fā)育[1]。在這些光感受器中，光敏色素能夠

調(diào)控種子的休眠過程。光敏色素A(phytochrome A，phyA)是高等植物中調(diào)控遠紅光誘導反應的主要光受體。phyA介導的遠紅光能促進種子休眠，這可能由phyA介導的高輻照度反應（High irradiance reaction,HIR）引起的[2]。

FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3(FHY3)和它的同源基因FAR-RED-IMPAIREDRESPO NSE 1(FAR1)編碼一類起源于轉(zhuǎn)座子酶的植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子[3-5]，被認為是phyA信號傳導途徑中重要的調(diào)控因子[6,7]。FHY3和FAR1能夠直接結(jié)合到FAR-REDELONGATED HYPOCOTYL 1(FHY1)和FHY1-like(FHL)的啟動子上，激活它們的表達，而FHY1和FHL的蛋白產(chǎn)物，在phyA的進核途徑中起著重要的作用[5,8]。對fhy3和far1突變體進行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)一系列由遠紅光誘導的基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到影響，進一步說明該同源基因參與phyA信號傳導[3]。FAR1，F(xiàn)HY3作為轉(zhuǎn)錄因子能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不同的靶基因來控制多種細胞過程。

目前對FAR1，F(xiàn)HY3的研究主要涉及UV-B信號[9]、生物鐘[10-12]、開花、葉綠體的生物起源[12]、葉綠素的生物合成[13]、細胞程序性死亡及活性氧的平衡[14]、ABA信號[15]、光信號與淀粉合成[16]。在擬南芥中，atfar1和atfhy3突變體植株的種子萌發(fā)率都比野生型的低，而雙突變體的更低，說明了FAR1、FHY3正調(diào)節(jié)擬南芥種子的萌發(fā)。

木本植物芽休眠是植物生長發(fā)育過程中的一種暫?，F(xiàn)象，是植物經(jīng)過長期演化而獲得的一種對環(huán)境及季節(jié)性變化的生物學適應性[17]。休眠的誘導是植物開始休眠的前提，植物一旦被誘導進入休眠就必須滿足需冷量以解除休眠，方可正常生長發(fā)育[18]。休眠的發(fā)生受溫度、光照等多種自然因子誘導[19]，其中，光照被認為是主要的環(huán)境信號因子，脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為一種重要的植物激素，調(diào)控種子休眠、芽休眠[20]。研究花芽誘導的分子機制，找到誘導芽休眠的主要調(diào)控途徑及關(guān)鍵基因，對調(diào)控設(shè)施果樹的栽培模式，改變設(shè)施鮮果的上市時間具有重要意義。本研究中以油桃‘中油四號’(Prunus persica var.nectariana cv.Zhongyousihao)為研究材料，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了桃樹花芽FAR1，F(xiàn)HY3在休眠誘導期間及脫落酸、遠紅光處理條件下的表達變化，旨在為進一步揭示FAR1，F(xiàn)HY3在轉(zhuǎn)錄水平上與芽休眠誘導的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2015～2016年在山東農(nóng)業(yè)大學設(shè)施果樹實驗室及山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站溫室大棚內(nèi)進行，選取中油四號油桃（Prunus persica var.nectariana cv.Zhongyousihao）為試材。

1.2 方 法

1.2.1 ‘中油四號’油桃花芽休眠誘導的界定 據(jù)新梢停長時間初步界定休眠誘導。測量新梢生長長度，并觀察葉片。新梢生長長度不再增加且枝條上只有老葉片，完全沒有新葉片分生出來時，判定為新梢停長。休眠誘導發(fā)生在新梢停長后。

采用清水插枝法進一步測定休眠狀態(tài)。每隔7 d采集樹冠外圍帶有花芽和葉芽的10根一年生枝條，除去葉片，剪去長的頂稍，將枝條基部剪齊，插入盛水2～3 cm深的塑料小桶中，在植物光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：氣溫25°C，光照強度40 μmol·m-2·s-1，晝/夜為14 h/10 h，相對空氣濕度80%～90%，每天換水1次，每次剪掉基部2～3 mm，露出新茬。記錄第一顆葉芽萌發(fā)的時間(d)，依此界定休眠狀態(tài)。當10 d≤第1顆芽萌發(fā)所需時間≤6周時，表明芽體已進入自然休眠誘導期。若連續(xù)6周未萌發(fā)，確定桃芽休眠誘導期結(jié)束，轉(zhuǎn)入深休眠期。隨著休眠的進行，需冷量不斷滿足，萌芽所需的時間變短，當再次出現(xiàn)10 d≤第1顆芽萌發(fā)所需時間≤6周時，表明芽體進入休眠解除期。

1.2.2 自然條件下自然休眠誘導期取材 每隔7 d取一年生枝上的花芽，立刻用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外源ABA處理 隨機采集一年生枝條200根，插入清水中預培養(yǎng)兩天（溫度25℃，光照強度為40 μmol·m-2·s-1，晝/夜：12 h/12 h，相對空氣濕度80%），分為兩組，分別為①對照（CK），清水+0.5%Trtion 100②脫落酸處理（ABA），100 μM ABA+0.5%Trtion 100，分時間段取樣，用液氮冷凍備用。

1.2.4 遠紅光處理 自8月份選擇生長一致、長勢健壯的桃樹進行遠紅光補光處理，并以不補光為對照。光源為18 W植物生長LED燈管，主峰波長730 nm。桃樹成直線排列，與補光燈管垂直，且在燈管的投影范圍之內(nèi)。每天20:00～4:00進行人工補光8 h，補光期間，進行常規(guī)管理，9月初取一年生枝上的花芽、樹皮和葉片，立刻用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 目的基因的查找及生物信息學分析 根據(jù)擬南芥FAR1、FHY3登陸的基因，在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中查得FAR1、FHY3的蛋白序列，與已建立的桃全基因組氨基酸序列（https://www.rosaceae.org/species/prunus/prunus_persica）進行Blast序列比對，初步篩選出同源氨基酸序列的候選基因，將這些基因通過Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行分析，去除無FAR1/FHY3保守結(jié)構(gòu)域的基因序列；再將候選的FAR1/FHY3相關(guān)基因序列通過Clustal W 工具進行多序列比對，去除重復序列。用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建進化樹，自舉檢測（Bootstrap）次數(shù)為1000。

從桃數(shù)據(jù)庫獲得每一個FAR1相關(guān)基因的基因組序列和編碼區(qū)序列，借助在線工具GSDS(http:// gsds.cbi.pku.edu.cn)繪制其內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)圖。

1.2.6 總RNA的提取和qRT-PCR采用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，USA）試劑盒提取樣品RNA，通過大連TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000、Prupe.2G327900的基因序列設(shè)計熒光定量特異性引物。采用Bio-Rad iCycler iQ熒光定量PCR儀，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa，中國大連)進行熒光定量PCR反應。反應體系為SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，中國大連)12.5 μL，上游、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL，總反應體系25 μL。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40次循環(huán)，反應結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。每個樣品重復3次，取平均值，采用Comparative CT(2?ΔΔCt)的方法計算實驗結(jié)果，采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of 5 FRS genes used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 休眠進程界定

圖1 中油四號桃樹休眠誘導的界定Fig.1 Definition for dormancy induction process in‘Zhong You Tao 4’peach

由圖1可知，自然條件下，9月11日中油四號桃樹新梢平均長度達到52.63 cm后不再增加，此時第一芽萌發(fā)所需時間為12 d，初步確定休眠誘導期的開始。2015年8月7日至10月22日采集的‘中油四號’油桃新梢進行清水插枝法培養(yǎng)，統(tǒng)計第一顆芽萌發(fā)時間結(jié)果如圖1所示。8月28至9月4日第1顆芽的萌發(fā)時間均小于10 d，認為其仍處于自然生長期；而在9月11日，新梢第1顆芽的萌發(fā)時間為12 d，9月11日到10月2日，第1顆芽的萌發(fā)時間大于10 d小于6周，表明芽體處于休眠誘導期。10月9日，第一顆芽萌發(fā)時間為51 d，大于6周，已經(jīng)進入深休眠期。

2.2 桃FAR1基因的系統(tǒng)進化分析

經(jīng)BLASTp同源搜索和Pfam在線工具分析結(jié)構(gòu)域，共獲得71條具典型FAR1結(jié)構(gòu)域的序列。將其與擬南芥FAR1/FHY3基因一起進行進化樹分析。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），得到5個與擬南芥 FAR1/FHY3同源性較高基因，Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000、Prupe.2G327900，我們將其統(tǒng)稱為FHY3/FAR1-related genes（FRSs）。由圖三可知，擬南芥FAR1(AT4G15090)、FHY3(AT3G22170)基因均含內(nèi)含子6個，外顯子7個，總長度分別為4079 bp和3867 bp。根據(jù)桃基因組公布的基因序列及基因結(jié)構(gòu)圖分析表明，Prupe.3G186100基因組序列為5216 bp，含有長度為2520 bp的CDS序列，編碼839個氨基酸，位于基因組第三條染色體上，由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成；Prupe.3G186200基因組序列為6247 bp，含有長度為2592 bp的CDS序列，編碼863個氨基酸，位于基因組第三條染色體上，由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成；Prupe.4G115100基因組序列為5004 bp，含有長度為2673 bp的CDS序列，編碼890個氨基酸，位于基因組第四條染色體上，由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成；Prupe.3G186000基因組序列為4269 bp，含有長度為2574 bp的CDS序列，編碼857個氨基酸，位于基因組第三條染色體上，由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成；Prupe.2G327900基因組序列為4348 bp，含有長度為2352 bp的CDS序列，編碼783個氨基酸，位于基因組第二條染色體上，由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成。

圖2 桃與擬南芥中FAR1、FHY3基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of FAR1、FHY3 from nectarine and Arabidopsis

圖3 桃與擬南芥中FAR1、FHY3基因的內(nèi)含子分布圖Fig.3 The distribution of introns in nectarine and Arabidopsis FAR1、FHY3 genes

2.3 自然條件下PpFHY3/PpFAR1在花芽休眠誘導期的表達分析

用RT-PCR分析FAR1s基因在‘中油四號’油桃花芽休眠誘導過程中的表達模式，結(jié)果如圖4所示。Prupe.3G186100在整個自然休眠誘導期表達量呈上升趨勢，至10月9日進入深休眠期，表達量持續(xù)上升，在9月25日差異顯著。Prupe.3G186200和Prupe.4G115100從9月11日到9月25日，表達持續(xù)顯著上升，在9月25日表達水平均達到最高值，Prupe.4G115100的表達量變化達到10倍以上，然后呈現(xiàn)降低的趨勢。Prupe.3G186000在整個自然休眠誘導期表達量呈逐漸上升趨勢，10月9日進入深休眠期，表達量下降。而Prupe.2G327900在整個自然休眠誘導期直至10月9日進入深休眠，表達量呈逐漸下降趨勢。

圖4 PpFRSs基因在自然休眠誘導過程中的表達變化Fig.4 Relative gene expression of peach FRSs genes during dormancy induction process

2.4 ABA處理對桃花芽中PpFRSs基因的表達調(diào)控

對‘中油四號’油桃枝條進行100μM ABA處理后，分時段取花芽，提取cDNA為模板，用PpFRSs成員的特異引物進行了qRT-PCR分析。

圖5 PpFRSs在100 μM脫落酸處理下的表達變化Fig.5 Relative gene expression of PpFRSs treated by 100 μM ABA

Prupe.3G186100受ABA誘導表達上調(diào)，在處理12 h時差異最顯著。Prupe.3G186200和Prupe.4G115100趨勢一致，在處理0～24 h內(nèi)，表達量上調(diào)，36～48 h表達量下調(diào)。Prupe.3G186000在處理12 h時表達量高于對照，24～48 h處理組表達下調(diào)。Prupe.2G327900在處理12～36 h表達量低于，48 h表達量高于對照。處理 12 h，除Prupe.2G327900表達下調(diào)，Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000的表達均上調(diào)。

2.5 遠紅光處理對桃花芽中FHY3/FAR1基因家族成員的表達調(diào)控

圖6 PpFRSs在遠紅光處理下的表達變化Fig.6 Relative gene expression of PpFRSs treated by far-red

為了研究遠紅光對PpFRSs的誘導作用及在花芽中是否具有特異性，我們以一年生樹皮和葉片作為參照，對PpFRSs的表達進行了分析。熒光定量顯示（圖6），遠紅光處理后，在花芽中，Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000的表達受誘導下調(diào)，Prupe.2G327900表達上調(diào)。在一年生韌皮部中，Prupe.3G186100、Prupe.2G327900的表達下調(diào)，Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000表達上調(diào)。葉片中，Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.2G327900受遠紅光誘導下調(diào)，Prupe.4G115100、Prupe.3G186000上調(diào)。Prupe.3G186100、Prupe.3G186200在不同組織中的變化趨勢基本一致，均受遠紅光誘導下調(diào)，而Prupe.4G115100、Prupe.3G186100在花芽中特異性下調(diào)，一年生韌皮部和葉片中都誘導上調(diào)。Prupe.2G327900受遠紅光誘導在花芽中特異性上調(diào)，一年生韌皮部和葉片中表達下調(diào)。

3 討論

FAR1、FHY3是一對同源蛋白，在phyA控制的遠紅光反應中起著重要的作用。在擬南芥基因組中，除FAR1、FHY3外，還有12個FHY3/FAR1相關(guān)的基因，命名為FRS(FHY3/FAR1-related genes)家族基因[4]。在以往的研究中指出，F(xiàn)HY3和FARl是由古老的MURA類轉(zhuǎn)座酶進化而來，獲得調(diào)控基因表達的能力[21]。本試驗將擬南芥中的FAR1、FHY3蛋白序列比對桃樹基因組，找到了71條類似序列。通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)PpFRSs都含有FRS家族保守的核心轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)域。序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，Prupe.3G186100與擬南芥FAR1(AT4G15090)，Prupe.3G186200與擬南芥FHY3(AT3G22170)同源性最高，其次分別為Prupe.4G115100、Prupe.3G186000、Prupe.2G327900。基因結(jié)構(gòu)圖顯示，Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100與擬南芥FAR1、FHY3外顯子數(shù)目一致。

落葉果樹的休眠是長期自然選擇的結(jié)果，是其度過冬季不良環(huán)境的一種生物學適應性[22]。休眠的誘導是植物開始休眠的前提，植物一旦被誘導進入休眠就必須滿足需冷量以解除休眠，方可正常生長發(fā)育，休眠的開始受環(huán)境因素誘導，而光照在休眠誘導中起主要作用[18]。phyA作為遠紅光的主要光受體，通過細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)移來誘導一系列遠紅光響應基因的表達，進而調(diào)控種子的萌發(fā)、幼苗的去黃化等過程。在模式植物擬南芥中，遠紅光能夠誘導FAR1、FHY3表達下調(diào)[5]，而FAR1/FHY3作為遠紅光途徑中重要的調(diào)控因子，還能夠結(jié)合脫落酸相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ABI5，連接光信號途徑和激素信號途徑，共同影響種子休眠，且FAR1、FHY3的表達可以被ABA誘導[15]。Leida等[23]發(fā)現(xiàn)桃花芽休眠和種子休眠具有一定的相似性。遠紅光能夠誘導種子休眠，因此，PpFRSs也可能參與了桃樹花芽的休眠誘導。本研究發(fā)現(xiàn)，Prupe.3G186100、Prupe.3G186000在整個休眠誘導期表達量持續(xù)升高，Prupe.3G186200、Prupe.4G115100在休眠誘導期呈先升高后降低的趨勢，但表達水平一直高于自然生長期，可能參與了桃花芽的休眠誘導過程。用ABA處理桃花芽，PpFRSs也響應了ABA信號。遠紅光處理桃樹，以一年生樹皮和葉片作對照，發(fā)現(xiàn)4個同源性最高的PpFRSs基因在花芽中表達下調(diào)，與擬南芥中的研究一致。Prupe.2G327900在整個休眠誘導過程中及受ABA、遠紅光處理后的表達量趨勢均與其它4個基因趨勢相反，可能通過不同的模式參與休眠誘導的調(diào)控。

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Expression Analysis of FAR1/FHY3-related Genes Involved in Nectarine Floral Buds during Dormancy Induction

HUAN Lei1,WANG Xu-xu1,LIU Wen-hai3,LI Ling1,2,GAO Dong-sheng1,2*
1.College of Horticulture Science and Engineering/Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China
2.State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China
3.Weifang Engineering Vocational College,Weifang 261000,China

FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3(FHY3)and its homolog FAR-RED IMPAIRED RESPONSE1(FAR1)，are involved in the regulation of seed germination induced by far red and abscisic acid，but the transcriptional changes of FHY3/FAR1 in dormancy induction process of flower bud is still to be explored.The homologous genes of Arabidopsis thaliana in peach were firstly identified by NCBI blast toolkit.At the same time the expression pattern of the five highest homology genes was characterized during the dormancy induction course，far-red light conditions and ABA-treated conditions， respectively， in floral buds of seven-year-old‘Zhongyousihao’nectarine(Prunus persica var.nectariana cv.‘Zhongyousihao’).Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that the expression of Prupe.3G186100,Prupe. 3G186200，Prupe.4G115100,and Prupe.3G186000 have a up-regulated tendency during the dormancy induction course, also，their transcripts are up-regulated by ABA，down-regulated by far-red light.Conversely，Prupe.2G327900 transcript is down-regulated during both the dormancy induction course and ABA-treated conditions，but up-regulated by far-red light. According to the aforementioned results,we could speculate that PpFRSs may be involved in dormancy induction of flower bud through different methods.

ABA;bud dormancy induction;expression analysis;far-red;FHY3/FAR1

S662.1

:A

:1000-2324(2017)02-0229-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.014

2016-11-23

:2016-12-10

山東省自然科學基金(NO.ZR2014CM015)

郇 蕾(1991-),女,碩士研究生,研究方向:果樹生理與分子.E-mail:huanleisheshi@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:dsgao@sdau.edu.cn