李超++畢鵬翔++董妍++雷佳宇++袁曉環(huán)++郭艷芹

[摘要] 目的 研究姜黃素類似物H8對Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）誘導的PC12細胞凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響。 方法 CCK-8法檢測Aβ25-35及姜黃素類似物H8的細胞毒性，以Aβ25-35誘導PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）建立AD細胞模型，并使用不同濃度的H8進行干預，通過RT-qPCR法檢測各組凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達。 結果 H8在實驗濃度范圍內(nèi)幾乎無細胞毒性，Aβ25-35具有明顯的細胞毒性并呈濃度依賴性，經(jīng)過H8干預后細胞存活率明顯升高，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。經(jīng)過H8作用后能降低Aβ25-35誘導的Caspase-3、Bax mRNA表達，升高Bcl-2 mRNA表達。 結論 姜黃素類似物H8能夠抑制Aβ25-35誘導的凋亡相關基因，發(fā)揮抗凋亡作用。

[關鍵詞] 姜黃素類似物；細胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）10-0001-04

Effects of curcumin analogues on cell apoptosis induced by Aβ25-35 in AD cell model

LI Chao BI Pengxiang DONG Yan LEI Jiayu YUAN Xiaohuan GUO Yanqin

Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin analogue H8 on the expressionof apoptosis-related genes Caspase-3， Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）. Methods The cytotoxicity of Aβ25-35 and curcumin analogue H8 were detected by CCK-8. The AD cell model was established using PC12 cells （rat adrenal pheochromocytoma cells） induced by Aβ25-35 and the cells were treated with different concentrations of H8. The expression of Caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA were detected by RT-qPCR. Results H8 had almost no cytotoxicity in the experimental concentration range， while Aβ25-35 had obvious cytotoxicity and concentration-dependent. The cell survival rate was significantly increased after H8 intervention， among them， 20 μmol/L H8 was most significantly（P<0.001）. After treatment with H8 could reduce Aβ25-35-induced Caspase-3， Bax mRNA expression and increase Bcl-2 mRNA expression. Conclusion Curcumin analogues H8 can inhibit Aβ25-35-induced apoptosis-related genes， with anti-apoptotic effect.

[Key words] Curcumin analogues；Cell apoptosis；Caspase-3；Bcl-2；Bax

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為認知功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退和喪失[1]。AD的發(fā)病機制十分復雜，研究表明，神經(jīng)細胞凋亡在AD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2]。姜黃素（curcumin）是一種低分子量酚類化合物，提取于姜黃、郁金等姜黃屬植物的根莖中，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、神經(jīng)保護等多方面的藥理作用[3，4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制Aβ誘導的神經(jīng)細胞凋亡。然而，姜黃素在體內(nèi)的生物活性低、代謝快、吸收少、生物利用率低，極大地限制了其應用[5]。本實驗以姜黃素為母體去掉其β-二酮基團，設計了穩(wěn)定的、分子量更小的戊-1，4二烯-3-酮類似物（H8）。本研究利用Aβ25-35誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）建立AD細胞模型，觀察姜黃素及其類似物對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響并觀察其中凋亡相關基因及蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的變化，闡明姜黃素類似物H8治療AD的可能機制，為研究和治療阿爾茨海默病提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（上海同仁化工DOJINDO）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國羅氏公司Roche）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green熒光染料（美國羅氏公司Roche）；姜黃素類似物H8[本課題組合成其化學名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環(huán)戊酮，HPLC檢測純度為99.3%]；Amyloid β-Protein Fragment 25-35（美國Sigma，貨號A4559）。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；超凈工作臺（德國ESCO）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；分光光度計（美國Beckman公司）；熒光定量PCR儀（美國 ABI stepone）。

1.3 細胞

PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）購自上海中國科學院細胞庫。

1.4 Aβ25-35配制方法

將1 mg Aβ25-35溶于943 μL三蒸水，配成1000 μmol/L母液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使之老化，分裝，于-20℃凍存。

2 實驗方法及分組

2.1 PC12細胞的培養(yǎng)

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12），為貼壁生長細胞，使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[內(nèi)含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）]，于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天細胞貼壁后換液，當細胞匯合度達到70%～80%時傳代，細胞傳代貼壁后呈梭型，并有較長的突觸，取對數(shù)期生長細胞用于實驗。

2.2 CCK-8法檢測Aβ25-35、H8的細胞毒性

PC12細胞按4000個/孔的密度接種于96孔板，用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的藥物。實驗分組為對照組、H8組、Aβ25-35組。H8組的濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，Aβ25-35組的濃度為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，藥物作用24 h后，觀察細胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標儀450 nm處測定OD值，計算Aβ25-35的IC50值。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

2.3 姜黃素類似物H8對Aβ25-35誘導的AD細胞模型細胞活性的影響

根據(jù)方法2.2結果最終選擇40 μmol/L的 Aβ25-35為最適造模濃度。將處于對數(shù)期生長的PC12細胞按4000個/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL。第一孔為對照孔，第2～6孔分別加入含H8的培養(yǎng)基預處理2 h，使其終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L，然后加入Aβ25-35使其終濃度為40 μmol/L，共處理24 h，每個實驗孔同時設置4個副孔。藥物作用24 h后，觀察細胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標儀450 nm處測定OD值。

2.4 RT-qPCR檢測姜黃素及H8對Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表達的影響

取對數(shù)期生長的PC12細胞按4×105/mL的密度接種于6孔板，實驗分為五組：（1）空白對照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；（2）Aβ組：40 μmol/L Aβ25-35處理24 h；（3）低濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+5 μmol/L H8；（4）中濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+10 μmol/L H8；（5）高濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+20 μmol/L H8。各實驗組首先使用H8預處理細胞2 h，然后加入40 μmol/L Aβ25-35共處理22 h，24 h后收集細胞提取RNA，采用RT-qPCR技術檢測各組細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達，通過2-ΔΔCT計算各基因相對表達水平。

2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（x±s）表示，使用One-way ANOVA對結果進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細胞毒性

在進行細胞實驗之前，首先對姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細胞毒性進行考察，如表2所示：與對照組（DMSO）相比，不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的H8作用于細胞24 h后，均沒有引起明顯的細胞毒性，說明H8在檢測濃度范圍內(nèi)對細胞幾乎無毒性。 表3示：Aβ25-35干預PC12細胞，藥物濃度為5 μmol/L時，細胞存活率為（86.82±2.74）%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨著Aβ25-35濃度增加，細胞存活率逐漸下降，當Aβ25-35濃度增加到40 μmol/L時，細胞存活率下降至（44.62±1.26）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。根據(jù)SPSS 16.0 軟件計算IC50值為39.6 μmol/L，故選擇40 μmol/L Aβ25-35為造模濃度。

3.2 H8對Aβ25-35誘導的AD細胞模型的影響

加入不同濃度的H8干預后觀察對Aβ25-35誘導PC12細胞活性的影響。如表4所示：與對照組相比，Aβ組細胞存活率明顯下降（P<0.001）；與Aβ組相比，經(jīng)過10、20、40 μmol/LH8干預后細胞存活率明顯升高（P<0.001），其中20 μmol/L的H8作用最明顯。以上實驗表明姜黃素類似物H8能抵抗Aβ25-35誘導的細胞毒性，發(fā)揮保護作用，提高細胞存活率。

3.3 Aβ25-35與H8對PC12細胞形態(tài)的影響

按方法2.3 加入不同濃度的Aβ25-35培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化如封三圖1A所示：對照組細胞多呈梭型形，立體感強，細胞飽滿，折光度好，突觸較長，大多數(shù)具有小的突起，細胞密集，細胞碎片少。而經(jīng)過不同濃度的Aβ25-35作用下，細胞總數(shù)量相對變少，細胞胞體皺縮，突觸變短消失，貼壁性差，有脫壁漂浮現(xiàn)象，細胞碎片較多。隨著Aβ濃度越大，細胞的狀態(tài)越差，細胞碎片也越來越多。經(jīng)過不同濃度H8干預后細胞數(shù)量增加，細胞形態(tài)明顯得到改善（封三圖1B）。

3.4 姜黃素類似物H8對凋亡相關基因表達的影響

按方法2.4使用不同濃度的H8預保護2 h，除對照組外其他各組給予40 μmol/L Aβ25-35誘導細胞凋亡。RT-qPCR方法檢測H8對凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響。從表5中可以看出，與對照組相比，Aβ組的Bax、Caspase-3基因mRNA表達均增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），Bcl-2基因的mRNA表達下降（P<0.001）；與Aβ組相比，H8低、中、高劑量組的Bax、Caspase-3 mRNA表達均下降（P<0.05或P<0.01或P<0.001），而Bcl-2基因的mRNA表達上升（P<0.05或P<0.01）。以上結果表明，Aβ誘導PC12細胞可使促凋亡基因Bax、Caspase-3表達升高、抗凋亡基因Bcl-2表達降低，經(jīng)H8作用后可降低凋亡基因表達、增加抗凋亡基因表達，因此，H8具顯著的抗凋亡作用。

4 討論

阿爾茨海默病的病理特征為：細胞外異常淀粉蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑和細胞內(nèi)過度磷酸化的Tau蛋白和微管形成的神經(jīng)纖維纏結[6，7]，此外，還有因細胞凋亡而導致廣泛的神經(jīng)元和突觸的丟失[8]。Aβ是構成SP的核心成分，也是神經(jīng)纖維纏結以及血管淀粉樣變性的生化基礎[9]。Aβ可以通過多種途徑引起促細胞凋亡因素增加和抗凋亡的因素減少，最終引起神經(jīng)元的變性、凋亡和壞死[10]。Horiuchi M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，β淀粉蛋白過表達和過度沉積是神經(jīng)元功能障礙的觸發(fā)者，在大腦內(nèi)注射Aβ能夠使神經(jīng)元受損[12]。因此，拮抗Aβ誘導的細胞凋亡可能是治療AD的一種方法。

姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護等多種藥理作用。但姜黃素在體內(nèi)的活性偏低、水溶性差、口服后體內(nèi)代謝過快和生物利用度低[5，13]，這主要是由于姜黃素結構中β二酮結構片段的不穩(wěn)定性所造成的[14，15]。本實驗室通過化學合成方法設計了姜黃素類似物H8[化學名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環(huán)戊酮，純度為99.3%]，前期經(jīng)過HPLC檢測姜黃素類似物H8降解率低，并且穩(wěn)定性較好。

本實驗以Aβ25-35誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）建立AD細胞模型，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度Aβ25-35作用于細胞后，細胞存活率逐漸下降，細胞形態(tài)明顯改變：細胞胞體皺縮，突觸變短消失，出現(xiàn)凋亡的表現(xiàn)，并呈劑量依賴性。經(jīng)過H8干預后細胞存活率明顯升高，細胞形態(tài)得到改善，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。RT-qPCR方法檢測結果發(fā)現(xiàn)，Aβ作用于細胞后抗凋亡基因（Bcl-2 mRNA）表達降低，促凋亡基因（Bax mRNA）表達升高，使用H8干預后改善了這一現(xiàn)象，提示H8能在基因水平對抗Aβ引起的細胞凋亡。

綜上，由于姜黃素類似物H8能有效地抑制Aβ誘導的細胞損傷，發(fā)揮抗凋亡作用，因此，深入研究和開發(fā)姜黃素類似物對阿爾茨海默病的治療和預防具有重要意義。

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（收稿日期：2017-02-26）