胡中慧， 馬慧萍， 樊鵬程， 李加恒， 王俊麗， 蒙 萍， 賈正平△

(1. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科， 2. 蘭州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所， 甘肅 蘭州 730050)

PC12 細(xì)胞在缺氧條件下的自噬現(xiàn)象*

胡中慧1,2， 馬慧萍1， 樊鵬程1， 李加恒2， 王俊麗2， 蒙 萍1， 賈正平1△

(1. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科， 2. 蘭州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所， 甘肅 蘭州 730050)

目的：考察PC12細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生與缺氧時間的關(guān)系，探討自噬對缺氧細(xì)胞的影響作用。方法：以PC12細(xì)胞為模型，將對數(shù)生長期的細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，37℃、 5% CO2培養(yǎng)24 h后，放入0.5% O2、94.5% N2和5% CO2的培養(yǎng)箱缺氧1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h 和48 h，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體，Westen blot法檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)的表達(dá)，用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)活性、活性氧自由基(ROS)和線粒體膜電位(MNP)水平，探究缺氧不同時間自噬對PC12細(xì)胞的作用。結(jié)果：在缺氧3～12 h， PC12細(xì)胞自噬明顯增加，自噬相關(guān)蛋白(LC3B、 Atg5和Beclin1)表達(dá)增加，尤其是缺氧9 h， PC12細(xì)胞存活明顯增加，表明短時間缺氧自噬對細(xì)胞起保護(hù)作用，而隨著缺氧時間的延長細(xì)胞存活明顯降低，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平減少，細(xì)胞LHD和ROS水平明顯增加。MMP水平顯著下降，細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)論：在缺氧早期自噬對PC12細(xì)胞起保護(hù)作用，但缺氧時間較長，超過了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)能力導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

自噬；PC12細(xì)胞；缺氧；自噬相關(guān)基因

autophagy; PC12 cells; Hypoxia; autophagy-related genes(Atg)

【DOI】 10.12047/j.cjap.5319.2017.016

氧氣對所有真核細(xì)胞的正常發(fā)育、新陳代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。如果機(jī)體遭受氧供給不足或用氧障礙，各組織、器官和細(xì)胞均可出現(xiàn)缺氧應(yīng)激，發(fā)生許多病理生理變化及相應(yīng)的臨床癥狀[1]。為了適應(yīng)生存，機(jī)體在組織和細(xì)胞水平發(fā)生重大調(diào)整以適應(yīng)低氧環(huán)境。機(jī)體適應(yīng)缺氧的機(jī)制很多，近年來的研究進(jìn)展表明，在缺氧條件下，自噬已經(jīng)成為重要調(diào)節(jié)機(jī)制[2，3]。自噬(autophagy) 是通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、RNA)和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)，并轉(zhuǎn)送至溶酶體中降解，釋放氨基酸、核苷酸和脂肪酸等大分子物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)再循環(huán)，為細(xì)胞修復(fù)和重建提供原料，以滿足細(xì)胞代謝和細(xì)胞器更新需要[4]。自噬對細(xì)胞在應(yīng)激情況下( 如饑餓、缺氧) 的存活、程序性細(xì)胞死亡以及細(xì)胞內(nèi)病原體的清除有重要作用。研究表明[5]，細(xì)胞自噬過多或過少等異常現(xiàn)象會嚴(yán)重影響細(xì)胞和生物個體的生長、發(fā)育和衰老過程，可引發(fā)腫瘤、自身免疫性疾病、心血管病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種人類重大疾病。自噬是進(jìn)化過程中保守行為之一，酵母、哺乳動物都可以找到參與自噬的同源基因，現(xiàn)己統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因 (autophagy-related gene，Atg)[6]。其中Atg5、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin1)等自噬蛋白的定位、修飾及相互作用決定著自噬體的形成、加工、成熟與溶酶體的融合以及再生等動態(tài)過程[7]。

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化細(xì)胞株(pheochromocytoma，PC12)是公認(rèn)的對氧敏感的細(xì)胞,已被廣泛用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病及細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境氧含量的變化的信號傳導(dǎo)機(jī)制的一個模型系統(tǒng)[8]。本研究通過實(shí)驗觀察在缺氧條件下，PC12細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的自噬現(xiàn)象，探討自噬對缺氧細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清(均為蘭州民海生物有限公司)；青霉素(哈藥制藥集團(tuán)，批號：A120805410)；硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號：1205103)；鼠神經(jīng)生長因子(武漢海特生物制藥股份有限公司，批號20121265)；甲基噻唑藍(lán)四氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、25%戊二醛和ECL超敏發(fā)光液(均為Sigma公司)；LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；活性氧ROS檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)； RIPA裂解緩沖液(07B13A05)和BCA蛋白檢測試劑盒(AR0116)(均為BOSTER)；Anti-LC3B兔多克隆抗體(ab48394)和 Anti-Beclin 1 (ab137355)(均為abcam)；Anti-Atg5(Cell Singnaling Technology)；辣根標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體和辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(均為中杉金橋)。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧處理

PC12細(xì)胞株(購于上海中科院細(xì)胞庫)加入含10%馬血清和5%的胎牛血清及50 ng/ml鼠神經(jīng)生長因子的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，2.6 mg/ml碳酸氫鈉。PC12細(xì)胞培養(yǎng)于面積60 mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿中，置37℃、95% 空氣和5% CO2常氧培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞覆蓋80% 左右傳代，按每2天1∶3傳代，待傳代3～4次后，用于實(shí)驗。

PC12細(xì)胞缺氧處理：PC12細(xì)胞置37℃、95% 空氣和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿80%左右，放入95% N2和5% CO2缺氧培養(yǎng)箱，根據(jù)實(shí)驗的具體要求來設(shè)定缺氧時間，缺氧的環(huán)境條件除了氧氣濃度設(shè)置為0.5%之外，其他的外部條件都與常氧培養(yǎng)環(huán)境條件保持一致

1.2 細(xì)胞存活分析法

通過MTT 法檢測在缺氧條件下對PC12細(xì)胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，置缺氧箱中分別缺氧1、3、6、9、12、24、36和48 h。在缺氧時間到達(dá)后，每孔中加入MTT溶液，繼續(xù)置常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每個孔中加入DMSO，振搖15 min，經(jīng)多功能酶標(biāo)儀于490 nm測量OD值，光密度用來表示細(xì)胞的存活率，另設(shè)以正常氧培養(yǎng)為對照組(正常生長的細(xì)胞+培養(yǎng)基)。

1.3 透射電鏡觀察自噬

PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后，PBS洗滌、離心、收集細(xì)胞，采用戊二醛固定細(xì)胞，4℃過夜；用PBS漂洗；然后用 1%鋨酸固定液4℃固定，再用PBS漂洗；細(xì)胞脫水，把脫水后的細(xì)胞包埋在樹脂中，固化細(xì)胞；固定好的蠟塊經(jīng)超模切片機(jī)切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.4 LDH測定

PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后，吸取上清液50 μl，其他按照LDH檢測試劑盒說明書操作步驟加相應(yīng)反應(yīng)液，混勻，室溫放置3 min，用紫外分光光度計于440 nm測定各吸收值。每個缺氧時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次取平均值。

1.5 ROS測定

PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后，棄去上清液，加用不含血清的培養(yǎng)基(DMEM)稀釋DCFH-DA的工作液1 ml，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，棄去上清，洗滌兩次，PBS吹打均勻，用多功能酶標(biāo)儀測量各吸收值。ROS供氫體為陽性對照。

1.6 細(xì)胞膜電位(MMP)測定

取常氧和缺氧處理后的PC12，按照J(rèn)C-1檢測試劑盒說明書操作步驟加相應(yīng)JC-1染色工作液，37℃孵育20 min后，洗滌兩次，加入150 μl PBS，用多功能酶標(biāo)儀測量各紅綠熒光的吸收值，計算紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。CCCP(10 μmol/L)作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。重復(fù)測量3次，取平均值。

1.7 Western blot實(shí)驗

PC12細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理后，用無菌預(yù)冷的PBS溶液

清洗，向其加入RIPA裂解液，冰上裂解，收集裂解液，離心，收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣品所對應(yīng)的蛋白濃度。取30 μg蛋白在12%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用脫脂奶粉的TBST溶液封閉后，于一抗中孵育， 4℃過夜，再把PVDF膜放入二抗溶液中，在室溫下孵育后， TBST清洗，使用ECL對PVDF膜進(jìn)行顯色發(fā)光處理，利用Tanon-4200SF全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，對其進(jìn)行曝光處理。測定灰度值時，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析。每個缺氧時間點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺氧對PC12細(xì)胞的影響

用MTT法測得常氧下和缺氧下PC12細(xì)胞的存活率，在缺氧6 h時細(xì)胞存活率為0.73±0.09，而常氧下為0.68±0.08；在缺氧9 h時細(xì)胞存活率為0.77±0.06，而常氧下為0.75±0.10；在缺氧12 h時細(xì)胞存活率為0.70±0.09，而常氧下為0.78±0.08，細(xì)胞存活率明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。缺氧48 h后細(xì)胞存活率僅為0.49±0.06，細(xì)胞存活率顯著降低 (P<0.01)，結(jié)果表明細(xì)胞隨著缺氧時間延長存活率明顯下降(表1)。

GroupOD值NormoxiaHypoxia1h0.60±0.080.61±0.083h0.61±0.110.63±0.146h0.68±0.080.73±0.099h0.75±0.100.77±0.0612h0.78±0.080.70±0.09*24h0.73±0.090.61±0.09**36h0.76±0.090.54±0.05**48h0.78±0.100.49±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vsthe normoxic group

2.2 缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬現(xiàn)象

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬泡，有些自噬泡中包裹著線粒體。在缺氧3～12 h自噬明顯增加，而缺氧48 h，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，出現(xiàn)空泡樣或凋亡樣細(xì)胞死亡(圖1)。

2.3 缺氧條件下PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

自噬相關(guān)蛋白LC3[9]、Atg5[10]和Beclin1[5,6]參與自噬泡伸展、擴(kuò)張和形成，并在各種刺激誘導(dǎo)自噬起至關(guān)重要作用。通過Western blot實(shí)驗結(jié)果顯示LC3B和Atg5水平在缺氧1～24 h明顯增加(P<0.01)，36 h后開始下降。Beclin 1在缺氧1～6 h逐漸增加，在缺氧12～24 h明顯增加(P<0.05)，36 h后開始下降；而缺氧48 h顯著下降(P<0.01)，結(jié)果表明細(xì)胞隨著缺氧時間延長LC3、Atg5和Beclin1出現(xiàn)先增加再下降的趨勢(圖2，表2)。

Fig. 1 Representative electron microphototographs of autophagy in hypoxia (×8 000) A： Cells in normoxia. cellular, nuclear, endoplasmic reticulum and mitochondria morphology were normal, no autophagosomes; B～I(xiàn): Cells in hypoxia for 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48 h, respectively

Fig. 2 Representative Western blot images of the LC3, Atg5, Beclin 1 and β-actin protein levels in PC 12 cells for various hypoxic duration

GroupIATargetprotein:IAβ-actinLC3-II/LC3-IAtg5Beclin100.77±0.170.04±0.011.62±0.131h1.10±0.20**0.23±0.02**1.78±0.153h1.59±0.14**0.94±0.08**1.66±0.156h3.09±0.31**0.95±0.07**1.90±0.149h3.46±0.37**1.26±0.09**1.86±0.1412h3.10±0.26**1.25±0.15**2.16±0.27*24h2.17±0.17**1.16±0.09**2.00±0.17*36h1.18±0.11*1.01±0.07**1.75±0.1248h1.02±0.050.03±0.010.32±0.03**

*P<0.05,**P<0.01vs0 h group

2.4 不同缺氧時間下LDH、ROS和MMP指標(biāo)的考察結(jié)果

結(jié)果表明常氧下PC12細(xì)胞LDH為480.02±16.02 U/L，缺氧1～12 h，LDH降低，在缺氧9 h降至385.01±9.98 U/L，而缺氧36 h后LDH升高至523.58±10.20 U/L，與常氧組相比，顯著增加(P<0.05)；而ROS水平在缺氧1～9 h升高緩慢，而缺氧12 h后 ROS水平顯著增加(P<0.01)，在缺氧條件下，MMP下降(P<0.01)，隨著缺氧時間延長，MMP呈時間依賴性關(guān)系(表3)。

GroupLDH(U/L)ROSMMP0h480.02±16.0211.19±1.225.98±0.661h454.83±8.0822.03±1.34**4.77±0.46**3h446.65±18.0122.65±1.57**4.55±0.57**6h404.99±10.89**19.35±0.91**4.24±0.61**9h385.01±9.98**19.76±1.61**2.78±0.49**12h390.09±15.15**67.37±7.43**2.18±0.44**24h476.96±8.1457.80±5.29**1.50±0.39**36h523.58±10.20*34.34±2.32**1.14±0.19**48h510.57±7.66*41.38±6.27**1.19±0.11**

*P<0.05,**P<0.01vsthe 0 h group

3 討論

缺氧廣泛存在于多種病理生理環(huán)境中，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能。機(jī)體適應(yīng)缺氧的機(jī)制研究很多，越來越多文獻(xiàn)報道，自噬對缺氧細(xì)胞起保護(hù)作用。缺氧誘導(dǎo)的自噬不僅減少呼吸鏈中氧氣不足產(chǎn)生的自由電子，同時也會使細(xì)胞通過分解代謝產(chǎn)生ATP利于細(xì)胞在低氧環(huán)境下生存[11]。Zhang[12]等人研究表明，缺氧似乎是一個早期促生存的過程，可能作為對細(xì)胞預(yù)測極端應(yīng)激的報警信號。也有文獻(xiàn)報道耗竭自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1和LC3其中之一，會增加低氧下細(xì)胞死亡[13]。本研究結(jié)果顯示在不同缺氧時間自噬對PC12細(xì)胞的存活率有明顯影響，在缺氧早期細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多，自噬相關(guān)蛋白LC3B、 Atg5和Beclin 1表達(dá)增加，自噬現(xiàn)象明顯，細(xì)胞存活率也明顯增加。盡管自噬分子機(jī)制和生物功上有了新進(jìn)展，但在缺氧條件下自噬的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞存活還是死亡仍有爭議。有文獻(xiàn)報道自噬是一種不同于凋亡或壞死的細(xì)胞死亡形式[14]。本實(shí)驗結(jié)果也表明長時間缺氧，LC3B、 Atg5和Beclin 1表達(dá)減少，自噬現(xiàn)象減弱，推測長時間缺氧對細(xì)胞的損傷超過細(xì)胞自我修復(fù)能力時，會出現(xiàn)大量空泡樣死亡細(xì)胞。

近年來研究進(jìn)展表明，缺氧誘導(dǎo)的自噬可通過清除受損的線粒體，調(diào)控線粒體更新和循環(huán)利用，減少ROS產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞在低氧環(huán)境下生存[14,15]。LDH是機(jī)體能量代謝中的一種重要酶，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH大小可反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度。MMP是維持正常線粒體的膜結(jié)構(gòu)和功能不可缺少條件，耗損 MMP會產(chǎn)生線粒體碎片。線粒體是ROS生成的主要場所，也最易受ROS危害，受損線粒體會生成更多的ROS，從而出現(xiàn)氧化損傷的惡性循環(huán)。因此，及時有效清除受損線粒體對減輕細(xì)胞氧化損傷至關(guān)重要。通過透射電鏡實(shí)驗結(jié)果顯示在缺氧早期，PC12細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的自噬泡，其內(nèi)清晰可見包裹著線粒體，同時ROS水平升高緩慢，LDH增加趨勢和MMP下降趨勢相對減弱，而缺氧12 h后 ROS和LDH水平顯著增加，推測自噬在缺氧一定時間范圍內(nèi)可清除受損線粒體，減少ROS的產(chǎn)生，緩解線粒體膜電位的下降來維持線粒體的功能，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保護(hù)PC12細(xì)胞在低氧環(huán)境下存活，但缺氧時間長對自噬作用反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗中只是觀察了缺氧條件下，對PC12細(xì)胞自噬發(fā)生的表象，但如何調(diào)控自噬在防治缺氧策略中更有利還需進(jìn)一步研究。

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2015-06-08

2016-05-10

Q255

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