武 敏， 楊敬平， 徐喜媛， 郭智敏， 卜寶英

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院， 包頭 014010)

人質(zhì)子感知受體G2A和OGR1在低氧性肺動脈高壓患者外周血細胞中的表達*

武 敏， 楊敬平△， 徐喜媛， 郭智敏， 卜寶英

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院， 包頭 014010)

目的：檢測人質(zhì)子感知受體G蛋白偶聯(lián)受體2A(G2A)和卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體1(OGR1)在低氧性肺動脈高壓(HPH)患者外周血細胞中的變化。方法：研究對象選取31例HPH患者為低氧性肺動脈高壓組(HPH組)，男性16例，女性15例，年齡(65.19±5.86)歲。同時符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組診斷標準和呼吸衰竭診斷標準，選取30例健康體檢者為正常組(NC組)，男15例，女15例，年齡(63.47±6.16)歲。心臟彩超計算HPH組肺動脈壓力、進行血氣分析和肺功能檢測，采集外周血檢測G2A、OGR1基因mRNA表達水平、血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果：HPH組PaCO2較NC組明顯增高(P<0.05), 1 s用力呼氣容積占預計值的百分比(FEV1pro%)和1 s用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV1/FVC)明顯低于NC組(P<0.05)。HPH組外周血中G2A mRNA及TNF-α含量明顯高于NC組(P<0.05)。OGR1 mRNA與NC組無差別。HPH組G2A mRNA及TNF-α表達與肺動脈壓力呈顯著正相關(guān)。結(jié)論：肺動脈高壓患者外周血細胞中質(zhì)子感知受體G2A表達增加，TNF-α水平增加，G2A的表達和TNF-α水平與肺動脈壓力呈明顯正相關(guān)。

低氧性肺動脈高壓；質(zhì)子感知受體；G2A；OGR1；TNF-α

【DOI】 10.12047/j.cjap.5394.2017.022

低氧性肺動脈高壓(hypoxia induced pulmonary hypertension,HPH)是由于低氧引起血管內(nèi)皮細胞損傷，血管內(nèi)皮合成和分泌的各種血管舒縮因子平衡失調(diào)，導致肺動脈壓力和阻力增高，是肺源性心臟病發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)，嚴重威脅人類健康[1-3]。由慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease COPD)引起的低氧性肺動脈高壓致殘率、死亡率高，給家庭和社會帶來了沉重的負擔，迄今為止尚無有效的治療手段。因此闡明HPH發(fā)生機制及尋找有效治療手段，對防治HPH的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體1(ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1)亞家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類對質(zhì)子敏感的G蛋白偶聯(lián)受體，包括OGR1、T細胞死亡偶聯(lián)基因8(T-cell death associated gene 8，TDAG8)、GPR4及誘導細胞停滯于G2/M期的G蛋白偶聯(lián)受體G2A(G2 accumulation)等4種受體，統(tǒng)稱為OGR1亞家族受體[4，5]。它們廣泛表達于血管內(nèi)皮和平滑肌細胞中，與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、細胞骨架重組、免疫系統(tǒng)和血管系統(tǒng)功能等生理和病理過程密切相關(guān)，對生物體機能調(diào)節(jié)有重要意義。該亞家族可通過幾種異源三聚體G蛋白包括Gs，Gi，Gq及G12/13誘導多條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，執(zhí)行著不同功能。目前OGR1亞家族在血管系統(tǒng)的表達研究很少。本研究將通過檢測HPH患者質(zhì)子感知受體G2A、OGR1在外周血細胞中的表達，了解其在HPH中的變化，為進一步尋找早期診斷及治療低氧性肺動脈高壓提供理論依據(jù)

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選自2013年11月～2014年11月內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科住院的COPD存在HPH患者31例為低氧性肺動脈高壓組(HPH組)，男性16例，女性15例，年齡(65.19±5.86)歲。同時符合下述全部納入標準：符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組診斷標準[6]，超聲心動圖預測肺動脈收縮壓≥40 mmHg，動脈血氣分析符合呼吸衰竭診斷標準[7]。排除標準：除外支氣管哮喘、支氣管擴張癥、充血性心力衰竭、肺結(jié)核、閉塞性細支氣管炎、彌漫性泛細支氣管炎、左心疾病所致的肺動脈高壓，慢性血栓栓塞性肺動脈高壓，結(jié)締組織所致肺動脈高壓，合并肝、腎等其它慢性疾病史，合并有嚴重全身性疾病。同期本院健康體檢者30例為正常組(NC組)，男15例，女15例，年齡(63.47±6.16)歲。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 (1)心臟彩超：固定專人對所有患者于入院第1天進行心臟彩超檢查，包括右心功能指標，記錄收縮期右房壓、三尖瓣返流的最大壓差、肺動脈收縮壓數(shù)值。肺動脈壓力應(yīng)用超聲心動圖預測，方法為三尖瓣返流法估測肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure,PASP)，在無右室流出道梗阻及肺動脈狹窄的情況下，肺動脈收縮壓≈右室收縮壓，公式為RVSP=△P+SRAP(RVSP=右室收縮壓；SRAP=收縮期右房壓；△P=三尖瓣返流的最大壓差)。輕度三尖瓣返流時SRAP為0.667 kpa(5 mmHg)，中度三尖瓣返流時SRAP為1.333 kpa(10 mmHg)，重度三尖瓣返流時SRAP為2.000 kpa(15 mmHg)。(2)血氣分析：入組后即刻抽取動脈血，采用德國羅氏有限公司cobasb123血氣分析儀行動脈血氣分析檢測。(3)肺功能：使用德國耶格公司生產(chǎn)的Jaeger肺功能儀，固定專人對所有患者于入院第1天進行肺功能檢測，觀察第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%pro)、用力肺活量占預計值百分比(FVC%pro)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)指標。

1.2.2 外周血Real Time-PCR檢測外周血中G2A和OGR1的mRNA表達 (1)所有研究對象均于入組時采集外周靜脈抗凝血4 ml，2 ml抗凝血加入血液RNA穩(wěn)定劑室溫放置2 h，-70℃冰箱保存；另2 ml抗凝血于采血后1 000 r/min ×15 mim離心，上清液分裝于EP管中，-70℃冰箱凍存。按RNA prep pure 血液總RNA提取試劑盒(天根生化有限科技公司)操作說明進行血液中總RNA的提取，并合成cDNA。根據(jù)NCBI gene bank上編號NM_002046.3(GAPDH)，按SYBR Green I 定量PCR引物設(shè)計要求，利用Primerblast軟件設(shè)計質(zhì)子感知受體及內(nèi)參基因特異定量PCR引物:TH-G2A-F：5′-TTTGCCATCCCTCTCTCCAT-3′,TH-G2A-R：5′-GCTCTGCTTGATGCTCCTGAA-3′,產(chǎn)物長度236 bp；TH-OGR1-F：5′-TCGCCAAGGGCGTTTTC-3′,TH-OGR1-R：5′-GTCGGCGACGCAGTTGA-3′,產(chǎn)物長度148 bp；GAPDH-F：5′-ATGAACATGGCTGTGCCTTTG-3′GAPDH-R5′-AGCACCCCTAACCTTGTGC-3′，產(chǎn)物長度116 bp。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。(2)PCR反應(yīng)條件：預變形：95℃ 30 s；變形：95℃ 5 s；退火：60℃ 20 s；延伸：72℃ 30 s，共50個循環(huán)。(3)分析Real-Time PCR擴增曲線計算目的基因的表達水平以GAPDH為內(nèi)參，每組設(shè)4個平行孔；各標本目的基因CT值與內(nèi)參基因GAPDH CT值相減標化目的基因的表達量，用△CT法計算結(jié)果；公式為:平均相對含量%=未知樣品的相對含量/對照樣品的相對含量=2-平均△CT其中，△CT未知樣品=CT未知樣品-CT內(nèi)參。

1.2.3 ELISA法檢測血清中腫瘤壞死因子α蛋白含量 按照TNF-α ELISA定量檢測試劑盒(北京卡努生物科技有限公司)說明書操作進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 HPH組與NC組臨床特點的比較

HPH組與NC組相比在年齡、性別方面無顯著性差異。HPH組PaCO2較NC組明顯增高(P<0.05)。HPH組FEV1pro%、FEV1/ FVC%明顯低于NC組(P<0.05,表1)。HPH組PASP為(60.03±15.79)mmHg，NC組健康體檢者因為心臟彩超無三尖瓣返流，不能計算出PASP。

2.2 HPH組與NC組外周血G2A、OGR1 mRNA表達量的比較

以GAPDH RNA作為內(nèi)參，進行G2A和OGR1定量PCR檢測。 HPH組患者外周血中G2A的表達顯著高于NC組(P<0.01)，HPH組患者外周血中OGR1表達與NC組相比無差異(表2，圖1)。

GroupnGender(male/female)Age(years)PaCO2(mmHg)FEV1pro(%)FEV1/FVC(%)NC30 15/1563.47±6.1639.40±3.39109.0±18.382.6±3.6*HPH31 16/1565.19±5.8654.54±20.88*39.6±12.8*55.5±7.7*

HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; NC: Normal control; PaCO2: Pressure of carbon dioxide; FEV1: Forced expiratory volume in 1 s; FVC: Forced vital capacity

*P<0.05vsNC group

GroupnG2AOGR1NC307.33±5.391.40±0.98HPH3133.36±12.35**1.17±0.94

HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; NC: Normal control; G2A: G2 accumulation； OGR1: Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1

**P<0.01vsNC group

2.3 ELISA法檢測血清中TNF-α含量

HPH組TNF-α平均含量(0.26±0.09)ng/L顯著高于NC組(0.17±0.07)ng/L(P<0.01)。

2.4 HPH組質(zhì)子感知受體表達和TNF-α含量與PASP的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 直線相關(guān)分析，HPH組G2A 及外周血TNF-α含量與PASP呈顯著正相關(guān)(P<0.01，圖2),HPH組OGR1與PASP無相關(guān)。

3 討論

COPD是大氣中有害顆粒和有害氣體引起的肺部慢性炎癥進而引起肺部結(jié)構(gòu)重塑的一種疾病，長期缺氧導致肺循環(huán)阻力和肺動脈壓持續(xù)升高，引起肺血管結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，這一臨床癥狀被稱為低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)。研究發(fā)現(xiàn)，低氧低壓培養(yǎng)的SD大鼠肺動脈病例切片中缺氧組肺動脈壁增厚使管腔嚴重狹窄,而正常組大鼠肺動脈壁正常[8]。大量研究證明 COPD 患者存在氣道的炎癥。其炎癥反應(yīng)與COPD并發(fā)肺動脈高壓的關(guān)系日益受到關(guān)注。為了適應(yīng)和對抗低氧，機體會啟動炎癥和免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，HPH患者及大鼠造模的痰和支氣管肺泡灌洗液檢測，發(fā)現(xiàn)大量促炎癥細胞因子如TNF-α,IL-l和IL-6等顯著升高，這些因子可進一步增強炎癥反應(yīng)[9]。TNF-α由肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的一種細胞因子，為促炎細胞因子。本研究中低氧性肺動脈高壓組TNF-α的表達明顯高于健康體檢組，證實了TNF-α參與慢性缺氧下的肺血管收縮反應(yīng)、肺動脈高壓的形成。

Fig. 2 Correlation of expression level of the proton-sensing receptor, TNF-α and pulmonary artery pressure in HPH group A: G2A and PASP； B: OGR1 and PASP； C: TNF-α and PASP; TNF-α： Tumor necrosis factor-α; HPH: Hypoxia induced pulmonary hypertension; PASP: Pulmonary artery systolic pressure

本研究證實G2A在低氧性肺動脈高壓組高表達，且G2A表達與肺動脈壓力呈正相關(guān)，提示G2A參與了低氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。低氧性肺動脈高壓患者中G2A的表達明顯高于正常組，考慮與肺動脈高壓患者常伴有呼吸衰竭有關(guān)。呼吸衰竭所致缺氧或缺氧伴二氧化碳潴留狀態(tài)，機體內(nèi)環(huán)境呈酸性環(huán)境。在缺氧和炎癥情況下，由于細胞微環(huán)境缺氧引起無氧糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，導致炎癥部位形成酸性微環(huán)境[10]，酸性微環(huán)境可以廣泛調(diào)節(jié)多種細胞類型的促炎和抗炎反應(yīng)，從而加劇或改善炎癥及其相關(guān)疾病狀態(tài)[11,12]。免疫炎癥反應(yīng)是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，我們可以通過尋找和阻遏G2A參與的一條或多條關(guān)鍵信號通路的激活，達到最佳治療效果。

檢測G2A mRNA的表達可早期發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者，對質(zhì)子感知受體、炎癥因子與低氧性肺動脈高壓的關(guān)系研究可為臨床預防和治療 COPD 合并肺動脈高壓提供依據(jù)。同時為進一步研究質(zhì)子感知受體在肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展中的作用提供研究基礎(chǔ),為從分子水平早期干預肺動脈高壓進展提供理論基礎(chǔ)。

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Expressions of G2A and OGR1 in peripheral blood cells of patients with hypoxia induced pulmonary hypertension

WU Min， YANG Jing-ping△， XU Xi-yuan, GUO Zhi-min, BU Bao-ying

(The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， BaoGang Hospital, Baotou 014010， China)

Objective: To detect the expression changes of proton-sensing receptor G2 accumulation (G2A) and ovarian cancer G protein-coupled receptor 1(OGR1) in human peripheral blood cells in hypoxic pulmonary hypertension patients(HPH). Methods: Thirty-one patients with HPH were enrolled for HPH group(16 men and 15 women，age: (65.19±5.86) and thirty healthy persons were enrolled for the control group (NC group). The peripheral blood samples were collected and the mRNA expressions of G2A and OGR1 were determined by using real-time fluorescent quantitative PCR. The serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: PaCO2 was increased significantly in HPH group than that of the NC group (P<0.05). Forced expiratory volume in 1 sencond(FEV1)pro% and FEV1/forced vital capacity(FVC)in HPH group were significant lower than those of the NC group(P<0.05). The expressions of peripheral blood G2A mRNA and TNF-α in HPH group were increased dramatically than those of the NC group(P<0.05). The expressions of OGR1 mRNA in peripheral blood had no difference between HPH group and NC group. The expressions of G2A and TNF-α in HPH group were positively related to pulmonary artery pressure significantly. Conclusion: The expression of proton-sensing receptor G2A and the level of TNF-α are increased in peripheral blood cells of patients with pulmonary hypertension.The expressions of TNF-α,G2A and pulmonary artery pressure have positive correlation in the HPH group.

hypoxia induced pulmonary hypertension(HPH)； the proton-sensing receptor； G2A； OGR1； TNF-α

2015-12-08

2016-06-26

R56

A

1000-6834(2017)01-085-04

△【通訊作者】Tel： 0472-5992706； E-mail: yangron@ sina.com.cn