王紫監(jiān)， 劉俊芬， 蔣麗娜， 張立民， 劉桂青， 王淮淮， 趙自剛△， 牛春雨△

(1. 河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所， 張家口 075000； 2. 河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院， 宣化 075100； 3. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 張家口 075000)

腸淋巴液引流對失血性休克小鼠心肌組織ACE/ACE2的作用*

王紫監(jiān)1,2， 劉俊芬1,3， 蔣麗娜1， 張立民1， 劉桂青1， 王淮淮1， 趙自剛1△， 牛春雨1△

(1. 河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所， 張家口 075000； 2. 河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院， 宣化 075100； 3. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 張家口 075000)

目的：觀察失血性休克后小鼠心肌組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)/ACE2平衡的變化及腸淋巴液引流(PHSML)的作用。方法：BALB/c雄性小鼠24只，隨機分為對照組、假手術(shù)組、休克組、休克+引流組(n=6)。建立失血性休克模型，行液體復(fù)蘇；休克+引流組液體復(fù)蘇后，引流腸淋巴液。在液體復(fù)蘇后6 h或假手術(shù)組相應(yīng)時間點、對照組于麻醉后，留取心肌組織，qRT-PCR法檢測ACE、ACE2、血管緊張素II(Ang II)1型受體(AT1R)、Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(Mas1R)的mRNA表達(dá)，ELISA方法檢測Ang II和Ang (1-7)含量。結(jié)果：休克組小鼠心肌組織ACE與AT1R mRNA表達(dá)、Ang II水平均顯著高于對照組與假手術(shù)組，ACE2與Mas1R mRNA表達(dá)顯著低于對照組與假手術(shù)組、Ang (1-7)含量顯著低于對照組，ACE/ACE2、Ang II/Ang (1-7)、AT1R/Mas1R顯著高于對照組與假手術(shù)組；PHSML引流顯著抑制了失血性休克對這些指標(biāo)的作用。結(jié)論：失血性休克上調(diào)心肌ACE-Ang II-AT1R軸、下調(diào)ACE2-Ang (1-7)-Mas1R軸表達(dá)，引起ACE/ACE2失衡；PHSML引流下調(diào)ACE-Ang II-AT1R軸、上調(diào)ACE2-Ang (1-7)-Mas1R軸表達(dá)，在一定程度上維持了ACE/ACE2平衡。

失血性休克；腸淋巴液；引流術(shù)；心?。谎芫o張素轉(zhuǎn)換酶；小鼠

【DOI】 10.12407/j.cjap.5397.2017.015

失血性休克引起的心肌損傷是心肌收縮功能障礙、微循環(huán)障礙、多器官損傷導(dǎo)致休克難治甚至死亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1, 2]。研究表明，失血性休克后腸淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph，PHSML)回流是加重心肌結(jié)構(gòu)損傷、心泵功能障礙的重要因素[3-5]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)廣泛存在于與循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)的血管、心肌組織中，與腎性高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)生機制相關(guān)[6, 7]；此外還與失血性休克后的微循環(huán)障礙、組織低灌注密切相關(guān)[8]；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)-血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)-Ang II-1型受體(Ang II 1 receptor，AT1R)與ACE2- Ang (1-7)- Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(Mas related G protein coupled receptor, MasR1)是RAS的兩條關(guān)鍵軸，ACE/ACE2失衡參與了止血帶性休克腎、肺損傷的發(fā)生[9, 10]；但二者在失血性休克后心肌損傷中的作用如何？PHSML引流減輕心肌損傷的作用是否與調(diào)節(jié)ACE/ACE2平衡有關(guān)，值得研究。為此，本研究觀察PHSML引流對失血性休克小鼠心肌組織ACE、ACE2、AT1R、Mas1R mRNA表達(dá)以及Ang II和Ang (1-7)含量的影響，探討PHSML對失血性休克小鼠心肌組織ACE/ACE2平衡的作用，進(jìn)一步揭示腸淋巴途徑在失血性休克后心肌損傷發(fā)病學(xué)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

24只健康、清潔級BALB/c雄性小鼠，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(實驗動物許可證號SCXK(軍) 2007-004)，體重為20～28 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)后用于本實驗。根據(jù)動物實驗要求，實驗前所有動物需禁食12 h，并給予自由飲水。實驗過程中動物處置的方法依據(jù)實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。所有小鼠在麻醉后，隨機均分為：對照組(Control)、假手術(shù)組(Sham)、休克組(Shock)、休克+引流組(Shock+ drainage)(n=6)。

1.2 手術(shù)操作方法

按照本研究室常規(guī)方法建立小鼠失血性休克模型[11]，即：經(jīng)右側(cè)股動脈放血使平均動脈血壓至40 mmHg，維持在(40±2)mmHg水平60 min；經(jīng)左側(cè)股動脈行液體復(fù)蘇(放出的全血+等量林格氏液)，30 min完成；輸液結(jié)束后再觀察平均動脈血壓6 h。休克+引流組在輸液結(jié)束后，行腸淋巴液引流；假手術(shù)組僅進(jìn)行與休克組、休克+引流組相同的手術(shù)，但不放血、不輸液、不引流淋巴液，觀察至與休克組、休克+引流組相同的時間點；對照組麻醉后直接取材。

1.3 標(biāo)本留取

上述實驗程序結(jié)束后，即休克組、休克+引流組在輸液結(jié)束后6 h、假手術(shù)組在與休克組相同時間點、對照組在麻醉后，留取心肌組織，分為兩部分存于EP管中，保存于-80℃低溫冰箱中。其中，部分用于制備組織勻漿，應(yīng)用ELISA方法檢測Ang II和Ang (1-7)的含量；部分用于提取RNA，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測腎組織ACE、ACE2、AT1R、Mas1R的mRNA表達(dá)。

1.4 qRT-PCR分析

取冷凍的心肌組織，應(yīng)用Trizol試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)常規(guī)方法提取總RNA；總RNA濃度經(jīng)紫外分光光度計(Lambda 35，PE)檢測合格后，應(yīng)用FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，進(jìn)行PCR擴增(StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀，ABI)。引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物分別為：ACE：正義5’AGCACGACCCTTTACTGGTT3’，反義5’TCACCTGGGCTGTTAGGAAG3’，118 bp；ACE2：正義5’GGCTTCTGCCTTCACACTTC3’ ，反義5’CTGGCTTCTTTCTCCGTTGA 3’，100 bp；AT1R：正義5’AACTGCTGGTGTGCCCTACT3’ ，反義5’AACAGGCCATCTCACTG GTC3’，101 bp；Mas1R：正義5’CCTGGCAAAGGCAGGATCTA3’ ，反義5’TTCAGCAAAAC TCGGCAAGC3’，161 bp；GAPDH作為內(nèi)參(產(chǎn)品號PMM04)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min；循環(huán)次數(shù)依次為：38、39、40、38。每份標(biāo)本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，取均值，納入結(jié)果分析。

1.5 ELISA分析

取冷凍的心肌組織，常規(guī)方法制備10%組織勻漿；應(yīng)用ELISA試劑盒檢測Ang II、Ang (1-7) 水平(抗體由美國R&D公司生產(chǎn)、試劑盒由江蘇鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司合成)；標(biāo)準(zhǔn)曲線：Ang II為y=0.006x-0.000033x2+0.000000116x3(R2=0.9946)，Ang (1-7)為：y=0.005x+0.0000373x2-0.00000015x3(R2=0.9960)；應(yīng)用BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)檢測各組織勻漿的蛋白濃度，用于Ang II和Ang (1-7)的標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腸淋巴液引流對失血性休克小鼠心肌組織ACE/ACE2平衡的作用

休克組小鼠心肌組織ACE mRNA表達(dá)顯著高于、ACE2 mRNA表達(dá)顯著低于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)；腸淋巴液引流降低了失血性休克小鼠心肌組織ACE mRNA表達(dá)、提高了ACE2 mRNA表達(dá)水平，但仍分別高于或低于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)。休克組小鼠心肌組織ACE/ACE2比值顯著高于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)；腸淋巴液引流顯著降低了ACE/ACE2比值，但仍高于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)。假手術(shù)組ACE2 mRNA表達(dá)水平顯著低于、ACE/ACE2比值顯著高于對照組(P<0.05，表1)。

GroupACEmRNA(ACE/GAPDH)ACE2mRNA(ACE2/GAPDH)ACE/ACE2Control0.847±0.0392.254±0.4120.38±0.05Sham1.063±0.0580.596±0.059*1.80±0.08*Shock2.377±0.295*#0.046±0.006*#51.82±7.50*#Shock+drainage1.362±0.213*#△0.360±0.042*#△3.82±0.41*#△

ACE: Angiotensin converting enzyme

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

2.2 腸淋巴液引流對失血性休克小鼠心肌組織Ang II和Ang (1-7)水平的影響

失血性休克小鼠心肌組織Ang II含量顯著高于對照組與假手術(shù)組、Ang (1-7)含量顯著低于對照組(P<0.05)；腸淋巴液引流顯著降低了休克小鼠心肌組織Ang II含量、提高了Ang (1-7)含量(P<0.05)，與對照組與假手術(shù)組均無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，失血性休克小鼠心肌組織Ang II/Ang (1-7)比值顯著高于對照組與假手術(shù)組(P<0.05)；腸淋巴液引流顯著降低了休克小鼠心肌組織Ang II/Ang (1-7)比值(P<0.05)，與對照組和假手術(shù)組無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。

2.3 腸淋巴液引流對失血性休克小鼠心肌組織AT1R和Mas1R mRNA表達(dá)的影響

與對照組與假手術(shù)組比較，失血性休克引起小鼠心肌組織AT1R mRNA、Mas1R mRNA、AT1R/Mas1R差異有顯著性(P<0.05)；腸淋巴液引流降低了休克小鼠心肌組織AT1R mRNA表達(dá)水平、提高了Mas1R mRNA表達(dá)水平、降低了AT1R/Mas1R比值，與對照組與假手術(shù)組比較，差異有顯著性(P<0.05)。此外，假手術(shù)組Mas1R mRNA表達(dá)水平顯著低于、AT1R/Mas1R 比值顯著高于對照組(P<0.05，表3)。

GroupAngII(ng/g·protein)Ang(1-7)(ng/g·protein)AngII/Ang(1-7)Control7.95±1.457.17±1.201.11±0.33Sham7.87±1.736.99±1.611.17±0.35Shock2.87±2.71*#5.09±0.27*2.54±0.59*#Shock+drainage9.10±1.83△6.91±0.54△1.31±0.19△

Ang: Angiotensin

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

GroupAT1RmRNA(AT1R/GAPDH)Mas1RmRNA(Mas1R/GAPDH)AT1R/Mas1RControl0.316±0.0061.435±0.0410.221±0.004Sham0.406±0.0200.592±0.114*0.704±0.132*Shock2.454±0.259*#0.068±0.010*#36.940±8.171*#Shock+drainage0.835±0.036*#△0.271±0.014*#△3.092±0.211*#△

AT1R: Angiotensin II 1 receptor; Mas1R: Mas related G protein coupled receptor

*P<0.05vscontrol group;##P<0.05vssham group;#△P<0.05vsshock group

3 討論

失血性休克后，交感-腎上腺髓質(zhì)軸興奮，引起RAS活化，生成Ang II增多，Ang II與其受體AT1R結(jié)合后發(fā)揮縮血管效應(yīng)，這對于恢復(fù)回心血量、保證重要器官心、腦的血液供應(yīng)具有重要作用。但長期、持續(xù)的ACE-Ang II-AT1R軸活化，除了加重局部器官缺血外，也會引起心肌組織血管收縮引起缺血。研究發(fā)現(xiàn)，ACE-Ang II-AT1R軸在止血帶性休克后的肺、腎組織出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)，參與肺、腎組織損傷的病理過程[9, 10]；但在失血性休克后心肌損傷的過程中，ACE-Ang II-AT1R軸有何變化，尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克引起了小鼠心肌組織ACE、AT1R的mRNA表達(dá)與Ang II水平均顯著升高，而PHSML引流顯著降低了休克小鼠心肌組織的ACE、AT1R的mRNA表達(dá)與Ang II水平。研究結(jié)果表明，過度活化的ACE-Ang II-AT1R與休克后的心肌損傷有關(guān)，而PHSML引流減輕心肌損傷的作用是通過抑制ACE-Ang II-AT1R過度活化實現(xiàn)的。

ACE2作為ACE的同源物，通過催化Ang II轉(zhuǎn)化成Ang (1-7)、進(jìn)一步與MasR結(jié)合發(fā)揮擴張血管作用，在血壓調(diào)節(jié)中具有重要作用[12-14]。鑒于ACE2-Ang (1-7)-Mas1R軸對血管收縮的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，本研究觀察了失血性休克小鼠心肌組織ACE2-Ang (1-7)-Mas1R軸的變化及PHSML引流的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失血性休克顯著降低了小鼠心肌組織ACE2、Mas1R mRNA表達(dá)與Ang (1-7)含量，PHSML引流提高了休克小鼠心肌組織ACE2、Mas1R mRNA表達(dá)水平以及Ang (1-7)含量。這說明ACE2-Ang (1-7)-Mas1R軸受抑制可能與休克后的心肌損傷有關(guān)，可以考慮為，由于Ang (1-7)的含量降低，血管舒張功能下降，回心血量減少，加重心肌缺血，從而導(dǎo)致心肌缺血性損傷；而PHSML引流減輕心肌損傷的作用是通過增加ACE2-Ang (1-7)-Mas1R表達(dá)實現(xiàn)的，最為可能的是通過減少對ACE-Ang II-AT1R軸的刺激，從而提高了ACE2軸的活性。

ACE2-Ang (1-7)-MasR具有拮抗ACE-Ang II-AT1R的作用，RAS的穩(wěn)定離不開ACE-Ang II-AT1R、ACE2-Ang (1-7)-MasR的平衡[15]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失血性休克引起了小鼠心肌組織ACE/ACE2、Ang II/Ang (1-7)、AT1R/Mas1R顯著升高，且這種作用可以被PHSML引流有效地逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，失血性休克狀態(tài)下的PHSML回流參加了ACE/ACE2失衡的形成過程，調(diào)節(jié)二者平衡是PHSML引流發(fā)揮保護(hù)作用的機制之一。同時，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PHSML引流組小鼠心肌組織的ACE、AT1R mRNA表達(dá)仍高于對照組與假手術(shù)組，ACE2、Mas1R mRNA表達(dá)仍低于正常對照組與假手術(shù)組，這也說明，在失血性休克后，PHSML引流這一手段并沒有完全將ACE-Ang II-AT1R、ACE2-Ang (1-7)- Mas1R的平衡恢復(fù)正常。這些結(jié)果表明，失血性休克引起心肌組織ACE-Ang II-AT1R上調(diào)、ACE2-Ang (1-7)- Mas1R下調(diào)的因素除了PHSML回流的作用外，還有其它因素參與。當(dāng)然，這有待在今后的研究中進(jìn)一步關(guān)注。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，行假手術(shù)的小鼠心肌組織ACE2、Mas1R mRNA表達(dá)較對照組顯著降低、ACE/ACE2、AT1R/Mas1R顯著升高；究其原因，可能是由于手術(shù)創(chuàng)傷的因素刺激實驗動物引起的。

總的來說，失血性休克引起了心肌組織ACE-Ang II-AT1R軸上調(diào)、ACE2-Ang (1-7)-MasR軸下調(diào)，導(dǎo)致ACE/ACE2失衡；PHSML引流恢復(fù)了失血性休克小鼠心肌組織ACE/ACE2軸的平衡。研究結(jié)果也提示，探討減少PHSML回流的治療措施、關(guān)注改善ACE/ACE2平衡的治療手段，有利于防治失血性休克后的心肌損傷。此外，減少PHSML回流有利于改善失血性休克后的心肌收縮功能[3, 4]，那么，改善RAS平衡是否參與了心肌收縮功能的調(diào)節(jié)，這還有待于今后觀察RAS主要成分相關(guān)工具藥是否能夠恢復(fù)失血性休克后的心肌收縮功能。

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Role of mesenteric lymph drainage in the balance of ACE/ACE2 in murine myocardium following hemorrhagic shock

WANG Zi-jian1,2, LIU Jun-fen1,3, JIANG Li-na1, ZHANG Li-min1, LIU Gui-qing1, WANG Huai-huai1, ZHAO Zi-gang1△, NIU Chun-yu1△

(1. Institute of Microcirculation of Hebei North University, Zhangjiakou 075000; 2. the Second Affiliated Hospital of Hebei North University, Xuanhua 075100; the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

Objective: To observe the change of angiotensin converting enzyme (ACE) and ACE2 in the murine myocardium followed hemorrhagic shock and the role of post-hemorrhagic shock mesenteric lymph (PHSML) drainage. Methods: Twenty-four male mice were randomly divided into control, sham, shock, and shock+drainage groups. A hemorrhagic shock model was established and then fluid resuscitation was performed to the mice in the shock and shock+drainage groups, and the PHMSL was drained in the shock+drainage group after fluid resuscitation. After 6 h of resuscitation in the shock and shock+drainage groups or corresponding time in the sham group, or after anesthesia in the control group, the myocardial tissues were harvested for the determination of the mRNA expressions of ACE, ACE2, angiotensin II (Ang II) type 1 receptor (AT1R), and Mas related G protein coupled receptor (Mas1R) using the method of qRT-PCR, and the levels of Ang II and Ang (1-7) using the method of ELISA. Results: In the myocardial tissue of shock group, the ACE and AT1R mRNA expressions and Ang II level were significantly increased than those of the control and sham groups, the ACE2 and Mas1R mRNA expressions were significantly decreased than that of the control and sham groups, the Ang (1-7) level was decreased compared with the control group, the ratios of ACE/ACE2, Ang II/Ang (1-7), and AT1R/Mas1R in the shock group were significantly increased than the control and sham groups. Meanwhile, PHSML drainage obviously suppressed the effects of hemorrhagic shock on these indices. Conclusion: Hemorrhagic shock up-regulated the ACE-Ang II-AT1R axis, down-regulated the ACE2-Ang (1-7)-Mas1R axis, and induced the unbalance of ACE and ACE2 in myocardial tissue. PHSML drainage decreased the ACE-Ang II-AT1R axis and increased the ACE2-Ang (1-7)-Mas1R axis, resulted in the balance of ACE and ACE2.

hemorrhagic shock; mesenteric lymph; drainage; myocardium; angiotensin converting enzyme; mouse

河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育基金(CXRC1314)

2015-12-14 【修回日期】2016-10-17

R364.1；R331.4

A

1000-6834(2017)01-061-05

△【通訊作者】Tel： 0313-4029223， 0313-4029168； E-mail： zzghyl@126.com， ncylxf@126.com