趙倩倩， 景佳妮， 李海清， 劉 蓉， 李曉鵬， 崔香麗

(山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學實驗室， 太原 030001)

β3-AR阻斷劑SR59230A對大鼠胸主動脈張力及microRNA表達的影響*

趙倩倩， 景佳妮， 李海清， 劉 蓉， 李曉鵬， 崔香麗1△

(山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學實驗室， 太原 030001)

目的：探討β3腎上腺素受體(β3-AR)阻斷劑SR59230A(SR)對大鼠胸主動脈張力和microRNA(miRNA)表達的影響。方法：44只正常雄性SD大鼠，24只用于觀察SR對離體胸主動脈環(huán)張力的影響。另20只SD大鼠隨機分為對照組(control)及SR組(n=10)，SR組大鼠給予SR腹腔注射，control組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。給藥5周后2組大鼠進行無創(chuàng)血壓測量，并檢測胸主動脈環(huán)對去甲腎上腺素誘導的張力；留取2組大鼠胸主動脈組織，檢測SR對大鼠胸主動脈miRNA表達的影響。結果：①SR預孵時30 mmol/L KCl引起的離體血管環(huán)收縮張力增加(P<0.05)；②SR在體給藥5周后大鼠收縮壓升高(P<0.05)；③SR在體給藥后去甲腎上腺素(NA)濃度為1 μmol/L和10 μmol/L時誘導大鼠胸主動脈環(huán)張力增加(P<0.05，P<0.01)；④SR組大鼠胸主動脈18個miRNA表達下調，其中7個有統(tǒng)計學意義，分別是rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p和rno-miR-352；11個表達上調，其中4個有統(tǒng)計學意義，分別是rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p、rno-miR-499-5p。結論：SR59230A可引起大鼠胸主動脈血管張力增加，在體給藥后可使大鼠收縮壓升高及胸主動脈rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p、rno-miR-352表達下調和rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p、rno-miR-499-5p表達上調。

大鼠；SR59230A；胸主動脈；張力；microRNA

【DOI】 10.12407/j.cjap.5447.2017.002

腎上腺素受體在心血管系統(tǒng)的調節(jié)中起著很重要的作用，β1,2腎上腺素受體(β1,2adrenergic receptors，β1,2-AR)的作用已廣被人知，隨后β3-AR的出現(xiàn)再次引起人們的注意。該受體在心臟中主要介導心肌負性肌力效應[1, 2]。其在血管中介導血管舒張效應，1999年Trochu JN等研究發(fā)現(xiàn)選擇性β3-AR激動劑SR 58611可產生血管舒張效應且該效應可被β3-AR阻斷劑所抑制[3]。2002年，Rautureau Y等通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)β3-AR在胸主動脈及分離出的內皮細胞中均可轉錄合成[4]。但是Brahmadevara N等人對β3-AR在血管的舒張效應持質疑態(tài)度[5, 6]。迄今為止，β3-AR在血管的作用及相關機制尚不明確。近年來miRNA在心血管疾病中的作用也逐漸受到人們的關注，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可調節(jié)血管內皮細胞功能、血管平滑肌細胞增生、遷移等，綜上可以推測β3-AR對血管的效應可能與其對血管miRNA的調控有關。所以本實驗采用SR59230A干預觀察其對大鼠胸主動脈miRNA表達的影響，從而為研究β3-AR血管效應的相關分子機制提供實驗線索。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠44只，體重180～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(SCXK(京)2009-0019)。24只大鼠用于離體血管環(huán)實驗，大鼠在室溫22℃～25℃、濕度50%～60%、12 h∶12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝入飲食與水，飼養(yǎng)2周后開始實驗。其余20只大鼠隨機分為control組和SR組(n=10)：SR組大鼠給予SR腹腔注射5周，每次取SR59230A注射液1 ml，每日2次；Control組大鼠給予等量的生理鹽水腹腔注射，同樣在室溫22℃～25℃、濕度50%～60%、12 h∶12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝入飲食與水，給藥結束后開始實驗。SR59230A配制方法如下：25 mg的SR59230A溶解于2.5 ml DMSO配制成濃度為0.024 mol/L的SR59230A儲存液。取此儲存液35.4 μl溶解于10 ml的生理鹽水，成為85 nmol/ml的SR注射液。

1.2 試劑

SR59230A(3-(2-Ethylphenoxy)-1-[[(1S)-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl]amino]-(2S)-2-propanol oxalate salt)、二甲基亞砜(DMSO)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)均購自美國Sigma公司，重酒石酸去甲腎上腺素注射液購自天津金耀氨基酸有限公司，miRNeasy mini kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR kit、96 panel miScript miRNA PCR arrays、RNA Stabilization reagent、RNA zap購自德國QIAGEN公司。

1.3 離體血管灌流

1.3.1 血管環(huán)的制備 配制HEPES灌流液(mmol/L)：NaCl 144,KCl 5.8, Glucose 11.1, HEPES 5.0, MgCl21.2, CaCl22.5,用1 mol/L的NaOH將pH調至7.4。將SD大鼠麻醉后迅速取出其胸主動脈，置于4℃ HEPES液中，小心分離周圍的脂肪組織及結締組織，將其剪成4～5 mm長的血管環(huán)，用相應直徑的棉棒穿過血管擦拭去除內皮。將剪好的血管環(huán)置于盛有5 ml灌流液的水浴槽中，上端掛于連接張力換能器的細鋼絲環(huán)，下端穿過固定的L型金屬針，保持自然松弛狀態(tài)。浴槽中灌流液溫度為37.5℃并給予充氧。調零后給予血管環(huán)2 g的初始張力，15 min換1次灌流液，穩(wěn)定60 min后用30 mmol/L KCl溶液預收縮來檢驗血管活性，血管張力達到2 g且相鄰兩次收縮幅度相差<10%即可用于實驗。

1.3.2 內皮完整性檢測 在灌流液中加入去甲腎上腺素(noradrenaline, NA)使其終濃度為1 μmol/L，血管收縮達平臺期后加入Ach使其終濃度為10 μmol/L，觀察血管舒張情況，舒張百分比達70%以上表示內皮完整性較好。

1.3.3 大鼠胸主動脈張力檢測 (1)離體血管張力測定：分別保留和去除大鼠胸主動脈內皮，在SR預孵及不預孵的情況下給予30 mmol/L的KCl溶液預刺激，記錄血管收縮達到平臺期時的張力。(2)SR在體給藥5周后血管張力檢測：分別取2組大鼠胸主動脈環(huán)，隨后按濃度累計法依次加入NA，使其終濃度為0.01、0.1、1、10 μmol/L，待收縮穩(wěn)定后分別記錄血管張力。

1.4 無創(chuàng)血壓的測量

將待測大鼠放于BP-300A全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(購自成都泰盟科技有限公司)預熱箱中，儀器開啟后預熱20～30 min，待其溫度升高達到37℃后將大鼠置于合適的鼠籠并放于保溫箱中，測量前檢測傳感器的靈敏度以及系統(tǒng)是否漏氣，將加壓套套至大鼠尾根端，傳感器置于鼠尾中上部1/3處，待軟件上顯示出正常規(guī)律的脈搏波形后測量血壓，連續(xù)測量3～5次取平均值。整個過程中注意保持環(huán)境安靜，室溫保持在25℃左右。

1.5 miScript miRNA PCR Arrays

1.5.1 大鼠胸主動脈總RNA的提取 按照miRNeasy Mini Kit說明進行操作，步驟如下：(1)留取2組大鼠胸主動脈組織，將其放入盛有700 μl Qiazol裂解液的研磨在冰上充分研碎，將研好的組織移至離心管中，室溫靜置5 min。(2)加入140 μl氯仿，震蕩15 s，室溫放置3 min，12 000 r/min 4℃離心15 min。(3)離心后將上清液移至新的離心管，1∶1.5加入無水乙醇，攪勻后將混合液移至過濾管(由無菌離心管及過濾網組成)，9 200 r/min室溫離心30 s。(4)離心后保留過濾網上的RNA沉淀物，棄去離心管中的液體，加入700 μl的RWT Buffer，同上離心；再次棄去離心管中的液體，加入500 μl的RPE Buffer，同上離心，重復兩次。(5)換取新的離心管，打開蓋子1 min揮發(fā)殘余酒精。(6)均勻加入30～50 μl的RNase-free water，保證過濾網完全濕潤，靜置1～2 min使RNase-free Water與RNA完全互溶，24 000 r/min室溫離心1 min，離心管中的液體即為提取出的RNA。(7)利用Nanodrop 2000c分光光度計測量RNA的濃度及純度，純度參考范圍一般為1.8～2.2，檢測結束后將其置于-80℃冰箱保存。

1.5.2 反轉錄 按照miRNA逆轉錄試劑盒說明計算反應體系，每個反應體系體積為20 μl，包含RNA樣品：250～500 ng、miScript Reverse Transcriptase Mix：2 μl、5ⅹmiScriptHispec Buffer：4 μl、10ⅹmiScriptNucleics Mix：2 μl、其余為RNase-free Water。加好反應體系后震蕩離心，反應條件為：37℃ 60 min，95℃ 5 min。反轉錄結束后置于4℃保存待用。

1.5.3 miScript miRNA PCR Arrays 采用QIAGEN的miScript SYBR Green PCR試劑盒，CFX96 Real-time PCR儀。miRNA PCR Array的反應體系總體積為2 750 μl，包含10ⅹmiScript Universal Primer：275 μl、2ⅹQuantiTect SYBR Green PCR Master Mix：1 375 μl、RNase-free water：1 000 μl、cDNA模板：100 μl。將所有成分加入預先備好的離心管中，震蕩離心，隨后加入miScript miRNA PCR Arrays 96孔盤中，每孔加25 μl反應體系。室溫離心，放入熒光定量PCR儀中，反應條件為94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，40個循環(huán)。用基于ΔΔCT相對定量法分析實驗結果。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 內皮完整性檢測

在NA 1 μmol/L預收縮的基礎上給予Ach，使其終濃度達到10 μmol/L，內皮完整時可誘導明顯的舒張效應，其舒張百分比不小于70%(圖1A)，內皮去除時誘導的血管舒張減小(圖1B)。

2.2 SR59230A對30 mmol/L KCl誘導的大鼠胸主動脈血管環(huán)張力的影響

取正常SD雄性大鼠的胸主動脈環(huán)，保留內皮且未預孵SR時30 mmol/L KCl誘導的大鼠胸主動脈環(huán)的張力為(2.20±0.08)g(n=6)，當預孵SR時，其張力為(2.66±0.58)g(n=6)(P<0.05)；去除內皮層且未預孵SR時30 mmol/L KCl誘導的大鼠胸主動脈環(huán)的張力為(2.51±0.14)g(n=6)，當預孵SR后其張力為(2.77±0.33)g(n=9，P<0.05)。由以上結果可知SR預孵可使30mmol/L KCl誘導的大鼠胸主動脈環(huán)張力增大(圖2)。

Fig. 1 Endothelium integrity of rat thoracic aorta rings A： Relaxation induced by Ach in endothelium-intact ring； B： Relaxation induced by Ach in endothelium-free ring; Ach: Acetylcholine； NA： Noradrenaline

Fig. 2 Effect of SR59230A on the tension of rat thoracic aorta rings induced by 30 mmol/L KCl*P<0.05vsendothelium-intact group；##P<0.05vsendothelium-free group

2.3 SR59230A在體給藥對大鼠血壓的影響

SR在體給藥5周后通過尾動脈無創(chuàng)血壓測2組大鼠的收縮壓及舒張壓，SR組大鼠收縮壓及舒張壓都有升高的趨勢，control組大鼠收縮壓的均值為(123.40±9.44)mmHg(n=10)，SR組大鼠的收縮壓均值為(135.99±19.35)mmHg(n=6，P<0.05)；Control組大鼠舒張壓的平均值為(98.38±7.62)mmHg(n=10)，SR組大鼠的舒張壓均值為(107.56±15.27)mmHg(n=6，圖3)；由以上結果可知SR59230A在體給藥后可使大鼠收縮壓升高。

2.4 SR59230A在體給藥后大鼠胸主動脈環(huán)對NA收縮力的檢測

SR腹腔注射5周后取2組大鼠胸主動脈環(huán)離體灌流，待穩(wěn)定后給予NA(0.01-10 μmol/L)，1 μmol/L的NA誘導control組大鼠離體胸主動脈環(huán)產生的張力為(2.54±0.37)g(n=8，圖4A)，而誘導SR組大鼠離體胸主動脈環(huán)產生的張力為(3.28±0.81)g(n=10，P<0.05，圖4B、圖4C)；10 μmol/L的NA誘導control組大鼠離體胸主動脈環(huán)產生的張力為(2.86±0.45)g(n=8，圖4A)，而誘導SR組大鼠離體胸主動脈環(huán)產生的張力為(3.68±0.78)g(n=10，P<0.01，圖4B、圖4C)；由以上結果可知NA誘導SR組大鼠胸主動脈環(huán)產生的張力較大。

Fig. 3 Blood pressure measurement of rats*P<0.05vscontrol group

Fig. 4 Effect of SR59230A on the contraction of thoracic aorta induced by NA A： Control group (n=8)； B： SR group (n=10)； C： The contraction of rat thoracic aorta induced by NA(n=10)； NA: Noradrena line*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.5 SR59230A對大鼠胸主動脈miRNA表達的影響

采用miScript miRNA PCR arrays試劑盒對miRNA進行篩選后用基于ΔΔCT相對定量法分析。結果顯示與control組相比，SR組大鼠胸主動脈有29個miRNA表達改變，18個miRNA表達下調，其中rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p、rno-miR-352變化有統(tǒng)計學意義(圖5A)，11個miRNA表達上調，其中rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p、rno-miR-499-5p變化有統(tǒng)計學意義(圖5B)，推測這些miRNA的表達改變與β3-AR作用抑制有關。

Fig. 5 Influence of in vivo SR59230A application on the expression of miRNA of rat thoracic aorta A： Up-regulated miRNA； B： Down-regulated miRNA*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)選擇性β3-AR抑制劑SR59230A可使大鼠胸主動脈環(huán)張力增加，可見β3-AR在血管中誘導舒張效應。β3-AR最先發(fā)現(xiàn)于脂肪細胞，隨后在許多系統(tǒng)中都發(fā)現(xiàn)β3-AR的存在，BRL 37344的舒張效應已被證實存在于大鼠離體胃腸道平滑肌束[7, 8]，膀胱平滑肌及子宮平滑肌也都有β3-AR的分布且誘導舒張效應[9,10]。β-AR激動劑異丙腎上腺素、β3-AR激動劑SR 58611均可引起大鼠胸主動脈舒張效應且該舒張效應可被β3-AR阻斷劑所阻斷[3]，但也有學者質疑β3-AR在大鼠胸主動脈的存在及作用[5,6]。李曉鵬采用形態(tài)學及功能學方法證明了β3-AR在大鼠胸主動脈存在及舒張效應[11]。本實驗選用選擇性β3-AR抑制劑SR59230A研究其對胸主動脈環(huán)張力的影響，進一步研究β3-AR的舒張效應及其作用機制，發(fā)現(xiàn)其可使大鼠離體胸主動脈環(huán)張力增加；SR在體給藥后通過測量血壓可知抑制β3-AR后可使大鼠收縮壓升高，可知β3-AR可誘導大鼠胸主動脈舒張效應，這些結果提示β3-AR與高血壓等疾病有關系。

β3-AR舒血管效應的機制尚不明確，近年來研究較多的是NOS和PKA信號轉導途徑[3,11]。本實驗室已通過應用NOS抑制劑L-NNA及PKA抑制劑H-89表明β3-AR的舒血管效應與NOS和PKA途徑有關[11]。本實驗初步觀察了β3-AR對miRNA表達調控的影響。miRNA是一類大約22個核苷酸組成的內源性非編碼小分子RNA，通過抑制轉錄后基因表達或促進靶基因mRNA降解發(fā)揮作用。經研究發(fā)現(xiàn)它可參與個體發(fā)育、基因表達等生物學行為的調控，因此對基因功能的研究、疾病治療及生物進化探索有重要意義。miRNA已被報道參與多種血管疾病如肺動脈高壓、動脈粥樣硬化等的調節(jié)。在動脈粥樣硬化血管中，miR-103可能參與血管內皮炎癥的調節(jié)[12]。miR-145與miR-143的共同作用可促進血管平滑肌分化和抑制平滑肌細胞增殖[13]。let-7f, miR-22, miR-30c等表達下調及miR-322，miR-451的表達上調已經在肺動脈高壓大鼠肺組織得到證實[14]。許多研究者表明miR-21、miR-221/222、miR-24、miR-26a及miR-146a可直接介導血管平滑肌的增殖[15-17]。在此基礎上我們推測β3-AR可通過調節(jié)胸主動脈miRNA表達來達到舒張血管的效應?；谏鲜黾僭O，本實驗采用miScript miRNA PCR Arrays 96孔盤(心血管系統(tǒng)特異的miRNA表達譜)對control組及SR組大鼠胸主動脈miRNA進行定量分析，發(fā)現(xiàn)SR組大鼠胸主動脈有29個miRNA發(fā)生改變，其中rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p、rno-miR-352的下調有統(tǒng)計學意義，rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p、rno-miR-499-5p的上調有統(tǒng)計學意義?？梢娺@些miRNA在大鼠胸主動脈的表達與β3-AR的抑制有關。

綜上所述，本研究證明SR59230A可使大鼠胸主動脈張力增加，進一步證實了β3-AR的舒血管效應；同時發(fā)現(xiàn)抑制β3-AR可使大鼠胸主動脈rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p、rno-miR-352等表達下調以及rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p、rno-miR-499-5p等表達上調，提示β3-AR的舒血管效應與miRNA的調控有關。本研究進一步加深人們對β3-AR的認識，為高血壓等疾病的治療靶點提供了新的實驗依據(jù)，但β3-AR的效應與這些miRNA表達調控之間的關系及其機制還需進一步的研究。

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Effect of β3-AR antagonist SR59230A on the tension and microRNA expression of rat thoracic aorta

ZHAO Qian-qian, JING Jia-ni, LI Hai-qing, LIU Rong, LI Xiao-peng, CUI Xiang-li1△

(Department of Physiology, Cell Physiology Laboratory, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective: To explore the effects of SR59230A on the tension and microRNA (miRNA) expression of rat thoracic aorta. Methods: Forty-four SD rats were used in the experiment. Twenty-four rats were used to observe the effect of SR on the tension of thoracic aortic rings. Another 20 rats were randomly divided into control (n=10) and SR group(n=10). Rats in SR group were injected SR intraperitoneally，and in control group were given 0.9% of saline. After 5 weeks, the blood pressure of all rats were measured. Then the tension to NA and the expression of miRNA of thoracic aorta rings were measured. Results: (1) The tension of thoracic aortic rings responding to 30 mmol/LKCl were increased by pretreatment of SR (P<0.05); (2) After 5 weeks injection of SR, systolic pressure was increased (P<0.05); (3) The tension in SR group was increased in presence of 1 μmol/L and 10 μmol/L of NA (P<0.05,P<0.01). (4) After 5 weeks of SR in vivo application,18 miRNA were down-regulated, 7 of them had statistical significance, they were rno-miR-143-3p, rno-miR-29b-3p, rno-miR-31a-5p, rno-let-7b-5p, rno-miR-214-3p, rno-miR-222-3p and rno-miR-352; 11 miRNA were up-regulated, 4 of them had statistical significance, they were rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p and rno-miR-499-5p respectively. Conclusion: SR59230A increased the tension of rat thoracic aorta. In vivo administration of SR led to increase of systolic pressure of rat，down-regulation of rno-miR-143-3p、rno-miR-29b-3p、rno-miR-31a-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-214-3p、rno-miR-222-3p、rno-miR-352 and up-regulation of rno-miR-206-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-342-3p and rno-miR-499-5p.

rat； SR59230A； thoracic aorta； tension； microRNA

山西省自然科學基金(2012201104-8)；山西醫(yī)科大學科技創(chuàng)新基金([2012]11號)

2016-04-20 【修回日期】2016-10-19

R3

A

1000-6834(2017)01-006-06

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