林春麗+張海波+陳紅霞+侯春燕+云雨生
摘要:PCR技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù),該技術(shù)通過重復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫延伸等簡單的3個溫度循環(huán),能將靶DNA擴增數(shù)百萬倍,獲得極高的檢測敏感性。通過PCR技術(shù)對新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒的血清樣本進行檢驗,并對影響其檢測效果的因素進行了分析。
關(guān)鍵詞:牛腹瀉病毒(BVDV);PCR;引物
中圖分類號:S858.23 文獻標識碼:A 文章編號:1007-273X(2017)04-0005-02
牛病毒性腹瀉(黏膜病)是由牛病毒性腹瀉病毒[1](Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的傳染病,各種年齡的牛均易感染、以幼齡牛易感性最高。
牛病毒性腹瀉(黏膜?。┑牟≡w屬于披膜病毒科瘟病毒屬的成員。病毒粒子呈圓形,有囊膜,直徑50~80 nm。RNA核芯直徑(24±4)nm,分子量3×106,沉降系數(shù)80~90 s。
牛病毒性腹瀉(黏膜?。┛梢源┻^胎盤感染,特別是懷孕早期。其病毒血清抗體陰性的母牛一旦感染,常常通過胎盤使胎兒產(chǎn)生免疫抑制,引起持續(xù)性病毒血癥,如果小牛正常產(chǎn)出,病毒血癥能持續(xù)地帶入成年期,這種牛臨床貌似健康,血清中又無保護性抗體,但體內(nèi)始終帶毒,是牛群中最危險的傳染源[2]。
本研究是通過PCR技術(shù)檢驗新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒,排除患病牛,制備無病毒血清,進一步用于獸藥的研制,并對影響其檢測效果的因素進行了分析。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑 RNAiso plus,購自Takara公司;氯仿、無水乙醇、75%乙醇,DEPC水、ddH2O、DNA Marker購自TakaRa公司;核酸染料購自百泰克有限公司。
1.1.2 器材、儀器準備 1 000 μL槍,200 μL槍,50 μL槍,1 000 μL槍頭,200 μL槍頭,75%酒精棉,止血鉗,EP管,EP管架;PCR擴增儀(美國伯樂公司,型號為S1000)等。
1.1.3 樣品 共24個樣本,包括22個未知樣本(均為新生牛初血清),陰性對照和陽性對照。
1.2 方法
PCR技術(shù),即聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)是由Saiki發(fā)明,因其技術(shù)對世界生物醫(yī)學(xué)的巨大推動作用,獲得了1992年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎[3]。由美國PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的[4]。這項技術(shù)可在試管內(nèi)經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍,這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義,極大地推動了生命科學(xué)的研究進展。
1.2.1 提取步驟
(1)取2 mL無菌無酶EP管,加入RNA Siso Plus(裂解液)900 μL(加液過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品,需更換槍頭),再分別吸取待測血清樣品、陽性對照、陰性對照各200 μL于EP管中,每加一次樣品換一次槍頭。輕輕上下顛倒搖勻至底部無沉淀,顏色均一,冰盒中靜置5 min。將已檢測樣品放-20 ℃冷凍保存(陰性對照放在中間順序)。
(2)12 000 r/min、4 ℃離心1 min。加入200 μL的氯仿,上下顛倒20次混勻,至顏色均一為乳粉色,冰盒中靜置8 min。
(3)12 000 r/min、4 ℃離心15 min。在離心剩余2 min時準備新1.5 mL無菌無酶EP管,加入800 mL -20 ℃預(yù)冷的異丙醇。從離心機輕拿輕放取出EP管(離心后液體分為三層,底層為有機溶液層,中層蛋白質(zhì),上層上清液含RNA)。吸取400 μL上清液(分兩次,每次200 μL吸取,吸取上層液體時切勿碰觸或吸取中層蛋白質(zhì)),放入事先加好異丙醇的新1.5 mLEP管中,輕輕上下顛倒20次搖勻,-20 ℃靜置20 min[5]。
(4)12 000 r/min、4 ℃離心15 min。離心機中EP管擺放方向保持一致,以使沉淀在管底同一側(cè)。若離心后不出沉淀繼續(xù)-20 ℃放置10~20 min后離心。棄上清,保留沉淀。沉淀即為RNA提取物,量很少,在倒上清液時注意切勿將沉淀倒出。
(5)加入1 mL75%乙醇(DEPC水配制,加乙醇過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品,需更換槍頭),輕輕上下顛倒,洗滌沉淀,將沉淀懸浮起來即可。
(6)7 500 r/min、4 ℃離心5 min。棄上清,保留沉淀。用200 μL槍頭將管底殘余乙醇液體吸凈,吸取一個樣品換一個槍頭,注意不要碰觸和吸取到RNA沉淀。
(7)EP管中的RNA在超凈工作臺中室溫下自然干燥10 min。加入20 μL的無RNase水(將水加到沉淀上),輕彈溶解沉淀,短期使用-20 ℃保存,長期使用保存于-70 ℃下。
1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫,使用引物設(shè)計軟件Primeier 5.0設(shè)計BVDV特異性引物(表1、表2)。
PCR反應(yīng):反應(yīng)體系:25 μL,配制在冰盒上進行,設(shè)定好反應(yīng)程序后,將裝有上述體系液體PCR反應(yīng)管包括對照管(空白PCR體系管和水樣PCR體系管)放入Smart CycLer System中按照表3參數(shù)設(shè)定PCR儀進行 PCR反應(yīng)。
1.2.3 電泳分析
(1)制膠。稱取1.35 g瓊脂糖粉放入錐形瓶中(注:倒入過程中避免瓊脂糖粉末粘在錐形瓶壁上)。加入90 mL 1×TBE溶液,微波爐加熱無絮狀物至完全溶解(注:至少沸騰3次),取出錐形瓶后,冷卻至60 ℃左右,加入17μL的核酸染料,搖至徹底混勻后倒入帶有梳子的膠槽中(輕輕混勻即可,避免氣泡產(chǎn)生),冷卻凝固40 min。
(2)將制好的膠放入電泳槽中,倒入1×TBE,液位高于膠面2 mm。
(3)用移液槍取樣品與6×Loading Buffer混合點于膠孔中。
(4)將電泳儀正負極對應(yīng)連接,開啟電泳儀電源開關(guān),在120 V電壓下電泳50 min。將跑完的瓊脂糖凝膠從電泳槽取出,放在凝膠成像儀中,進行觀察。
2 結(jié)果與分析
2.1 結(jié)果
由圖2可見,12號為陰性對照,無明亮的條帶;24號為陽性對照,出現(xiàn)明亮的條帶,證明試驗成立。剩余樣本在316 bp處,8、9、10、11、20、21、23號出現(xiàn)明亮的條帶,說明該樣本血清樣本染牛腹瀉病毒。
2.2 影響PCR檢測的因素
2.2.1 dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200 μmol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等,如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配[6]。
2.2.2 Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著影響。在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200 μmol/L 時,Mg2+濃度為1.5~2.0 mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
2.2.3 溫度與時間的設(shè)置 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點[7]。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95 ℃變性,再迅速冷卻至40~60 ℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75 ℃,在Taq DNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。
2.2.4 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30~40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。一般認為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48 h以內(nèi)完成電泳檢測,有些最好于當日電泳檢測,大于48 h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則,甚至消失。所以精細的分子實驗,操作過程的每一步都必須謹慎細致,才可保證準確的實驗結(jié)果。
參考文獻:
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[7] 金宇良.PCR技術(shù)的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012(10):47-48.