劉晉冀+楊潔鴻

摘要：采用不同毛色的牛皮作為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法對(duì)周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）在成年牛皮膚中的表達(dá)進(jìn)行定位和定性研究。結(jié)果表明，CDK-5在牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明CDK-5可能與牛毛色形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）；毛囊；毛色；免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)：S823；Q344+.13 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2017）03-0005-02

周期素依賴性蛋白激酶-5（Cyclin dependent kinase 5，CDK-5）是CDKs家族的成員之一，屬于小絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，因?yàn)樗哂信c其他的CDK成員同源的序列而得名[1]。但CDK-5的功能卻不同于其他CDKs成員那樣參與細(xì)胞周期的調(diào)控，而是主要參與神經(jīng)元正常功能的維持[2]。最初認(rèn)為CDK-5僅在神經(jīng)元中表達(dá)，但近年的研究發(fā)現(xiàn)CDK-5在非神經(jīng)元的組織或細(xì)胞中廣泛表達(dá)并發(fā)揮作用。牛（Cattle）是中國(guó)傳統(tǒng)物種，也是非常常見的物種之一。牛作為經(jīng)濟(jì)型大型哺乳動(dòng)物，除了肉、奶等畜牧產(chǎn)品外，皮毛作為農(nóng)業(yè)附屬品，也同樣具有研究?jī)r(jià)值。動(dòng)物皮毛中的黑色素種類、數(shù)量以及分布情況決定其毛色的表達(dá)，其中酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)毛色形成發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中酪氨酸羥化酶（TH）是TYR重要的激活因子之一，而TH酶的活性受細(xì)胞CDK-5的調(diào)控，因此CDK-5可能在毛色形成過(guò)程中發(fā)揮作用。哺乳動(dòng)物的毛色受許多基因的控制，這些基因通過(guò)相互作用決定毛色的產(chǎn)生。研究CDK-5與牛毛色的關(guān)系，不僅會(huì)通過(guò)實(shí)踐操作對(duì)免疫組化有一個(gè)定性的認(rèn)識(shí)，而且可以依據(jù)學(xué)術(shù)界先鋒對(duì)羊駝的毛色形成的研究作出假設(shè)，對(duì)CDK-5是否對(duì)所有動(dòng)物的毛色形成有關(guān)系這一問(wèn)題提供一個(gè)實(shí)例[3-8]。白色毛色是由于黑色素細(xì)胞數(shù)量較少，黑素體內(nèi)黑色素含量也少，毛根中明顯缺乏黑色素細(xì)胞及其前體的緣故[9]。哺乳動(dòng)物的皮膚和毛發(fā)色素沉著決定于其所含真黑色素與褐色素的相對(duì)數(shù)量[10，11]。因此，試驗(yàn)對(duì)CDK-5在黑白兩色牛皮膚中的表達(dá)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取黑白毛色的牛體側(cè)皮膚，剃毛后刮凈表皮，用取皮器取出黑白各2塊牛皮膚組織，置于4%的中性甲醛溶液中固定18 h，石蠟包埋，切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人、大鼠、小鼠CDK-5多克隆抗體、HRP-山羊抗兔LgG、DAB顯色試劑盒（DB公司）；PBS緩沖液，正常兔血清，DAB顯色液，Triton試劑（聚乙二醇辛基苯基醚），無(wú)水乙醇，蘇木精染料，KD-BM生物組織包埋機(jī)、KD-2508切片機(jī)，HPP-9160電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、Leica DMLB顯微鏡。組織包埋及切片制作免疫組織化學(xué)流程參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.3 免疫組化圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，每頭牛取3張切片，每張切片用DP軟件采集5個(gè)視野，對(duì)染色結(jié)果用Image-ProPlus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，進(jìn)行陰陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CDK-5在白色和黑色牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽(yáng)性表達(dá)，反應(yīng)陽(yáng)性物分布在胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，對(duì)照組未觀察到陽(yáng)性細(xì)胞（圖1）。由圖1可知，在黑白兩色牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽(yáng)性免疫反應(yīng)物，預(yù)示了CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發(fā)揮著某種生物學(xué)功能。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在黑白牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽(yáng)性免疫反應(yīng)物，表明CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發(fā)揮著某種生物學(xué)功能。皮膚毛囊外根鞘內(nèi)含有大量的黑色素細(xì)胞，正常的黑色素細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)為核小和胞漿不明顯[12]，而毛球是產(chǎn)生生黑素細(xì)胞并直接向毛干輸送黑色素的惟一部位[13]。研究發(fā)現(xiàn)，CDK-5是一個(gè)能使體內(nèi)外的酪氨酸羥化酶（TH）發(fā)生磷酸化的激酶[14]，TH在許多位點(diǎn)被不同的激酶磷酸化后不同程度地影響著TH酶的活性[15-17]。TH被CDK-5磷酸化后，TH的蛋白水平和活性均增加，如果缺少CDK-5，TH蛋白將不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解。TH是TYR的活性之一，而TYR是在黑色素合成的起始過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶。

本研究結(jié)果顯示，黑白色牛皮膚中存在CDK-5基因和蛋白的表達(dá)量，與文獻(xiàn)觀點(diǎn)相結(jié)合，推測(cè)CDK-5與牛毛色的形成相關(guān)。然而，CDK-5在牛毛色形成調(diào)控過(guò)程中的作用和其功能的驗(yàn)證還有待于進(jìn)一步的研究，本試驗(yàn)將為研究該基因與牛乃至其他哺乳動(dòng)物毛色形成的關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ)。

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