胡霞　徐維紅　劉佰明　鄒德玉　許靜楊　劉曉琳　白義川　谷希樹

摘要：小菜蛾是最早對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的重要農(nóng)業(yè)害蟲之一，而膜結(jié)合堿性磷酸酶是小菜蛾體內(nèi)疑似Bt毒蛋白的直接受體之一。我們?cè)谥暗墓ぷ髦锌寺×诵〔硕陦A性磷酸酶編碼基因PxALP1，本研究對(duì)該基因的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行了分析。在小菜蛾所有生命階段中，PxALP1基因在3齡幼蟲中表達(dá)水平最高；而在小菜蛾3齡幼蟲不同組織中，PxALP1基因在中腸中表達(dá)水平最高，這些都可能與PxALP1基因?qū)t毒蛋白產(chǎn)生抗性的生物學(xué)功能密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：小菜蛾；PxALP1；堿性磷酸酶；Bt毒蛋白受體；表達(dá)譜

中圖分類號(hào)：S436.341.2+4：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）04-0001-04

Analysis of Plutella xylostella ALP1 Gene Expression

Patterns at Different Time and Space

Hu Xia， Xu Weihong， Liu Baiming， Zou Deyu， Xu Jingyang， Liu Xiaolin， Bai Yichuan， Gu Xishu

（Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， China）

Abstract The diamondback moth， Plutella xylostella （L.）， is one of the important agricultural pests firstly producing resistances to Bt toxin. The membrane bound alkaline phosphatase is a potential direct receptor of Bt toxin in diamondback moth. We had cloned the coding ORF of Plutella xylostella alkaline phosphatase gene PxALP1 in previous works， so we analyzed the expression patterns of this gene at different time and space in this paper. Through the whole life span of Plutella xylostella， PxALP1 gene had the highest expression level in the 3rd instar larvae； and among all the tissues and organs of the 3rd instar larvae， PxALP1 gene had the highest expression level in the midgut. The expression patterns of PxALP1 gene might be closely related to the resistant function of Bt toxin.

Keywords Plutella xylostella； PxALP1； Alkaline phosphatase； Bt toxin receptor； Expression patterns

小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]屬于鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），又被稱為菜蛾、吊絲蟲等，是一種為害十字花科蔬菜的世界性害蟲，寄主多達(dá)40種以上，在我國(guó)各地均有分布[1]。小菜蛾主要以幼蟲為害十字花科蔬菜，嚴(yán)重影響十字花科蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。化學(xué)藥劑一直是防治小菜蛾的主要手段，頻繁用藥和小菜蛾本身世代短、繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)導(dǎo)致小菜蛾成為抗藥性最為嚴(yán)重的害蟲之一[2]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）毒素蛋白是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[3-5]。編碼Bt殺蟲蛋白的基因也作為最主要的殺蟲基因轉(zhuǎn)入到多種重要糧棉作物中，在害蟲防治中起著巨大作用[6，7]。但是小菜蛾亦能對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，并且是最早發(fā)現(xiàn)田間種群對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗藥性的害蟲。深入研究小菜蛾對(duì)Bt毒素的抗性機(jī)理，是有效防治害蟲的一個(gè)新思路[8，9]。

鑒定Bt毒蛋白在農(nóng)業(yè)害蟲體內(nèi)的作用靶標(biāo)，明確其抗性機(jī)理是當(dāng)前農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已有研究顯示，在多種昆蟲體內(nèi)堿性磷酸酶是Bt毒蛋白的直接受體，但在重要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾中，堿性磷酸酶的編碼基因及其生物學(xué)功能尚很少有人研究[10-13]。在以往工作中，我們成功克隆了小菜蛾的堿性磷酸酶基因PxALP1，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[14]。本研究擬利用Real-Time PCR建立檢測(cè)PxALP1基因表達(dá)量的方法，并在小菜蛾不同生命階段和不同組織中檢測(cè)PxALP1基因的表達(dá)水平，以期為闡明PxALP1在小菜蛾對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的分子機(jī)理提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本試驗(yàn)所用小菜蛾為天津市植物保護(hù)研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群，用無(wú)蟲甘藍(lán)苗繼代飼養(yǎng)20代以上，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度為60%～70%，光周期為 16L∶8D。根據(jù)試驗(yàn)需要取不同蟲態(tài)及組織供試。

1.2 主要試劑

TRIzol和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo Fisher公司，Real-Time PCR Kit購(gòu)自ABI公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

所用引物序列為PxALP1-qPCR-F：5′-CGGCATCGTGACGACATCAC-3′；PxALP1-qPCR-R：5′-CCGGGCTCGTTCTCCAGCAG-3′；EF1α-qPCR-F：5′-GCCTCCCTACAGCGAATC-3′；EF1α-qPCR-R：5′-CCTTGAACCAGGGCATCT3′。其中，引物PxALP1-qPCR-F和PxALP1-qPCR-R用于檢測(cè)靶基因PxALP1；引物EF1α-qPCR-F和EF1α-qPCR-R用于檢測(cè)組成型表達(dá)的延伸因子EF-1α（elongation factor-1α），為本試驗(yàn)的內(nèi)參基因[15]。

1.3 小菜蛾總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取小菜蛾幼蟲/成蟲50 mg或分離的各組織10 mg，液氮冷凍研磨后，用Trizol法提取小菜蛾總RNA，具體步驟參照Thermo Fisher公司的TRIzol試劑說(shuō)明書，最后溶解于 30 μL DEPC水中，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，直接使用或-80℃保存。

取1 μg總RNA，參照Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書，以O(shè)ligo（dT）18作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈。

1.4 Real-Time PCR方法

以cDNA樣本為模板，使用SYB Green PCR Kit試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR，檢測(cè)各樣本中PxALP1和內(nèi)參基因EF-1α的表達(dá)量，根據(jù)Real-Time PCR反應(yīng)曲線得到各樣本目的基因和內(nèi)參基因的Ct值 （threshold cycle number，域值循環(huán)數(shù)），每樣本測(cè)3次取平均值，采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算PxALP1基因的相對(duì)表達(dá)量和沉默效率。Real-Time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達(dá)水平檢測(cè)

分別取小菜蛾卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹、雌性成蟲和雄性成蟲的全部組織提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的相對(duì)表達(dá)水平。

Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線見圖1，熔解曲線見圖2。將Real-Time PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物均為單一目標(biāo)條帶（圖3），說(shuō)明Real-Time PCR能夠特異表征目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的表達(dá)水平。基于此，我們通過(guò)ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，PxALP1基因在小菜蛾卵、各齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲中均有表達(dá)，但在3齡幼蟲中表達(dá)水平最高，是其在卵中表達(dá)水平的20倍。

2.2 PxALP1基因在小菜蛾不同組織中的表達(dá)水平檢測(cè)

取PxALP1基因表達(dá)水平最高的3齡幼蟲，將其解剖為頭部、胸部、腹部、前腸、中腸、后腸、脂肪體和去腸道后表皮等不同組織，分別提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA，同樣通過(guò)Real-Time PCR方法檢測(cè)PxALP1在小菜蛾不同組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)PxALP1基因在小菜蛾中腸表達(dá)水平最高，是其在頭部表達(dá)水平的35倍。

3 討論與結(jié)論

處于不同生命階段的小菜蛾基因表達(dá)譜差異很大，對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因植物的敏感性也極不相同，因此有必要對(duì)PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達(dá)分布情況進(jìn)行探討。本研究通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)了PxALP1基因在小菜蛾卵、1齡

幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹、雌性成蟲、雄性成蟲期的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)該基因在小菜蛾的卵、各齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲中均有表達(dá)，但在3齡幼蟲中表達(dá)水平最高，是其在卵中表達(dá)水平的20倍。

此外，基因的表達(dá)具有極大的組織特異性，PxALP1基因在小菜蛾不同組織中的表達(dá)量也具有極大的差異。本研究通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)了PxALP1基因在小菜蛾3齡幼蟲頭部、胸部、腹部、前腸、中腸、后腸、脂肪體和去腸道后表皮等不同組織中的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)該基因在小菜蛾3齡幼蟲的中腸中表達(dá)水平最高，是其在頭部表達(dá)水平的35倍。

小菜蛾低齡幼蟲一般對(duì)Bt較為敏感，高齡幼蟲具有較強(qiáng)的Bt抗性。我們前期工作揭示了PxALP1基因編碼的膜結(jié)合堿性磷酸酶很可能是Bt毒蛋白在小菜蛾體內(nèi)的直接受體之一[14]，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PxALP1在3齡幼蟲中腸中表達(dá)水平最高，暗示PxALP1基因可能在小菜蛾對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性過(guò)程中具有一定作用，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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