張引紅，李美寧，王春芳，郭民，張銳虎，陳朝陽*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，太原 030001)

研究報告

補(bǔ)骨脂素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用

張引紅1，李美寧2，王春芳1，郭民1，張銳虎1，陳朝陽1*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，太原 030001)

目的 探討補(bǔ)骨脂素對II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用并初步探討其作用的分子機(jī)制。方法 選用DBA/1J小鼠，利用牛II型膠原誘導(dǎo)構(gòu)建類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為補(bǔ)骨脂素(PSO)、甲氨蝶呤(MTX)和模型對照(vehicle)三組，灌胃給藥，觀察關(guān)節(jié)改變情況并評分。稱重并計算脾指數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)測定脾淋巴細(xì)胞中Th1、Th2細(xì)胞數(shù)；ELISA檢測血清相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)量變化。結(jié)果 與vehicle組相比，PSO組足踝腫脹、活動受限程度明顯減輕； PSO組脾指數(shù)顯著低于模型對照組，Th1淋巴細(xì)胞所占比例亦較Vehicle組顯著下降，Th2淋巴細(xì)胞比例差異無顯著性；ELISA結(jié)果顯示PSO組血清TNF-α、IL-6和IL-1β顯著低于Vehicle組。各項結(jié)果PSO組與MTX組無統(tǒng)計學(xué)差別。結(jié)論 補(bǔ)骨脂素通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡及抑制TNF-α、IL-6和IL-1β起到免疫調(diào)節(jié)作用，從而緩解RA進(jìn)程。

補(bǔ)骨脂素；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型；炎癥因子；Th1/Th2;免疫調(diào)節(jié)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種引發(fā)機(jī)體多個關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥、以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)囊腫脹等病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。RA的發(fā)生發(fā)展與大量致炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)，最后引起關(guān)節(jié)部位的軟骨組織和骨質(zhì)不可逆破壞，是我國造成勞動力喪失和致殘的主要病因之一。臨床目前尚無有效緩解RA的藥物，主要應(yīng)用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤等控制病情對癥治療。這些藥物可改善RA的癥狀，但長期使用有較強(qiáng)的毒副作用，如抑制機(jī)體免疫功能等。因此尋找安全有效治療RA的藥物具有重要意義。補(bǔ)骨脂素(psoralen，PSO)來源于豆科植物補(bǔ)骨脂的果實，屬于呋喃香豆素類化合物，是補(bǔ)骨脂最重要的活性成分之一[1]。補(bǔ)骨脂被廣泛應(yīng)用于各類補(bǔ)腎健骨的方劑中，而且現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明補(bǔ)骨脂具有治療骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等藥理作用，提示其可能在骨質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[2-4]。本研究利用膠原誘導(dǎo)與人RA發(fā)生機(jī)制相似的小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，給予40mg/kg補(bǔ)骨脂素干預(yù)，與甲氨蝶呤組及模型對照組比較，探討補(bǔ)骨脂素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及相關(guān)炎癥因子分泌的影響，為RA的治療提供新的藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

DBA/1J小鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，體重20～22 g，35只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-0002】，實驗在山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室【SYXK(晉)2015-0001】進(jìn)行。適應(yīng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃和濕度(55±2)%，自由飲水，每日光照/黑暗各12 h。

1.1.2 試劑與儀器

牛II型膠原(CII)醋酸溶液、完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)：Chondrex公司；補(bǔ)骨脂素：成都曼斯特生物有限公司；注射用甲氨蝶呤：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；ELISA試劑盒(TNF-α, IL-6和IL-1β)：北京四正柏生物科技有限公司；Anti-Mouse CD4(FITC)、Anti-Mouse IFN-γ(PerCP)、Anti-Mouse IL-4(APC)：eBioscience公司。

微孔板分光光度計(BioTek公司，Epoch型), 流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACSCalibur型)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)的誘導(dǎo)

模型復(fù)制方法根據(jù)文獻(xiàn)描述方法稍作修改[5]。在超凈工作臺內(nèi)，將CII醋酸溶液與CFA等體積混和并充分乳化(在冰上操作)，將乳化好的液體滴在水中后，呈圓形且不擴(kuò)散，即為乳化完全。于DBA1/J小鼠尾根處后1～2 cm處皮下注射100 μL CII與CFA的混合乳液(含CII0.1μg) 進(jìn)行初次免疫，當(dāng)天記為1 d，到21 d用同樣的方法進(jìn)行第2次免疫。將CII醋酸溶液與IFA 等體積混和充分乳化，乳化和注射方法同初次免疫。此后，隔日觀察關(guān)節(jié)癥狀，記錄關(guān)節(jié)計分。

1.2.2 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)[5]

無紅斑或腫脹，記0分；1=踝關(guān)節(jié)有輕微的紅斑或一個趾的腫脹，記1分；2=踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和超過一個趾的腫脹，記2分；3=紅斑和踝部或腕部腫脹，記3分；4=全部紅斑及腳趾和踝部或手指和腕部等多關(guān)節(jié)的腫脹，踝或腕不能彎曲，記4分；每個小鼠四肢評分之和為關(guān)節(jié)計分。

1.2.3 分組及給藥

將造模成功的35只CIA小鼠隨機(jī)分為以下3組：CIA模型組(12只)、甲氨蝶呤陽性對照組(11只)、補(bǔ)骨脂素組(12只)。甲氨蝶呤陽性對照組和補(bǔ)骨脂素組在二免當(dāng)天開始給藥，連續(xù)灌胃給藥21 d。隔日觀察關(guān)節(jié)情況評分記錄。

1.2.4 炎癥因子測定

酶聯(lián)免疫吸附法測定各組小鼠血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量。將小鼠眼眶采血后，靜置30 min，于4℃，3000 r/min離心 10 min，小心吸取出上層血清，由酶聯(lián)免疫吸附法測得，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書進(jìn)行。

1.2.5 流式分析

常規(guī)提取脾淋巴細(xì)胞，計數(shù)后，嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，上機(jī)測試。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)外觀變化及評分

初次免疫后前3周，小鼠未出現(xiàn)足趾及足踝紅腫。進(jìn)行二免，并隨機(jī)分為補(bǔ)骨脂素(PSO)、甲氨蝶呤(MTX)、模型對照(vehicle)三組，給予相應(yīng)的灌胃處理，觀察記錄關(guān)節(jié)外觀并計分。二免后第1周各組小鼠均出現(xiàn)足踝及足趾腫脹、活動受限等關(guān)節(jié)炎癥狀，但各組間差異無顯著性；在第8天后，隨時間延長，PSO組關(guān)節(jié)腫脹較前減弱，關(guān)節(jié)僵直及活動受限程度均顯著優(yōu)于模型對照組(P<0.01)，與MTX組相比差異無顯著性(P>0.05)，評分結(jié)果見表2。如圖1所示，給藥7 d后，補(bǔ)骨脂素組與甲氨蝶呤組的關(guān)節(jié)計分無顯著增加，并進(jìn)而呈現(xiàn)略微下降趨勢，表明補(bǔ)骨脂素能夠減慢關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)程，緩解癥狀。

2.2 脾及Th1淋巴細(xì)胞變化

實驗終止時解剖取出脾，模型對照組小鼠脾體積明顯大于PSO組和MTX組。脾實體圖片如圖3。稱重計算各組小鼠脾指數(shù)，模型對照組(54.23±5.12)、PSO組(34.86±3.32)、MTX組(35.03±3.63)。PSO組脾指數(shù)顯著低于模型對照組(P<0.01)，與MTX組差異無顯著性(P>0.05)(圖4)。

分離脾淋巴細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析各組CD4+、IFN-γ+標(biāo)記的Th1占CD4+T細(xì)胞比例，如圖5所示：PSO組(14.58±0.42)%顯著低于模型對照組(28.17±1.56)%，與MTX組差異無顯著性(15.02±0.59)%。而CD4+、IL-4+標(biāo)記的Th2細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在各組間差異無顯著性。

2.3 炎癥因子水平的變化

實驗終止時取各組小鼠血清，利用ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-1β。結(jié)果顯示模型對照組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著高于PSO組和MTX組，差異有顯著性(P<0.01)，結(jié)果見表2。

表1 二免后關(guān)節(jié)計分結(jié)果Tab.1 Joint scores after the second immunization

注：與模型對照組相比**P<0.01。表2同。

Note.Compared with the vehicle group,**P<0.01.The same as in Tab.2.

表2 血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β比較Tab.2 Comparison of serum cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1β in the 3 groups

圖1 關(guān)節(jié)外形變化圖Fig.1 Gross changes in the joint shape

圖2 關(guān)節(jié)計分圖Fig.2 Joint scores

注：與模型對照組相比**P<0.01。圖4 脾指數(shù)圖Note. Compared with the vehicle group，**P<0.01.Fig.4 Spleen indexes in the three groups

3 討論

在模型構(gòu)建過程中，我們用注射器抽吸法制備乳化液，為避免注射器反復(fù)抽吸產(chǎn)生熱量，采取冰袋包繞注射器的方法，在50 mL三角瓶中進(jìn)行抽吸，比文獻(xiàn)用勻漿器乳化操作簡單，且大大減少了試劑損耗，經(jīng)濟(jì)實惠。在初次免疫21 d時進(jìn)行二免，此時，初免造成的尾根潰爛已脫痂，避免了因為尾根潰爛而造成二免失敗。

我們利用牛II型膠原成功誘導(dǎo)構(gòu)建了DBA/1J小鼠的CIA模型。研究顯示在CII免疫之后，補(bǔ)骨脂素組的小鼠關(guān)節(jié)計分明顯降低，實驗證實了補(bǔ)骨脂素對CIA病變關(guān)節(jié)有保護(hù)作用。CIA模型與人類RA患者在免疫學(xué)和病理變化方面具有較高的相似性，是廣泛使用的研究RA模型。

注：A：流式分析代表圖；B：統(tǒng)計分析圖(與模型對照組相比，**P<0.01)。圖5 脾淋巴細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例流式分析結(jié)果Note.A. Flow cytometry chart; B: Histogram.Compared with the vehicle group, **P<0.01.Fig.5 Ratio of Th1 cells in the splenic lymphocytes determined by flow cytometry

RA屬于自身性免疫疾病，目前研究者普遍認(rèn)為RA是抗原遞呈細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞作用的結(jié)果。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同可將CD4+T細(xì)胞分為Th1、Th2等細(xì)胞亞群。其中Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)啟動了RA的發(fā)生，而Th2細(xì)胞主要釋放抑制炎癥作用的細(xì)胞因子，因此Th1/Th2細(xì)胞的平衡與RA的進(jìn)展密切相關(guān)[6,7]。

我們的實驗結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素干預(yù)后病變處炎性細(xì)胞浸潤程度顯著降低，并可有效減少脾淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2比例平衡。RA促進(jìn)炎性因子TNF-α的釋放，TNF-α有進(jìn)一步促進(jìn)IL-6和IL-1β等炎性因子的釋放。我們檢測了在RA發(fā)病中具有關(guān)鍵作用的三種細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，補(bǔ)骨脂素處理后均呈顯著下降。提示補(bǔ)骨脂素可能通過抑制Th1細(xì)胞分化，減少TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，顯示出一定的抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用，從而緩解CIA病情，使發(fā)病程度降低.為臨床上RA的治療提供新的藥物奠定實驗基礎(chǔ)。補(bǔ)骨脂素發(fā)揮作用的詳細(xì)分子機(jī)制及毒副作用等有待于進(jìn)一步研究。

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Immunoregulatory effect of Psoralen on collagen-induced arthritis in mice

ZHANG Yin-hong1，LI Mei-ning2，WANG Chun-fang1，GUO Min1，ZHANG Rui-hu1，CHEN Zhao-yang1*

(1.Department of Laboratory Animal Science, Shanxi Key Laboratory of Laboratory Animal and Animal Model of Human Diseases,Taiyuan 030001,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)

Objective This study was designed to explore the therapeutic effect of psoralen on type II collagen-induced rheumatoid arthritis in mice and its molecular mechanism. Methods DBA/1J mice were immunized with type II bovine collagen to induce rheumatoid arthritis. The model mice were randomly divided into Psoralen group (PSO), methotrexate group (MTX) and model group (Vehicle). Clinical signs of arthritis in the mice were monitored. The spleen index was assessed. Splenic Th1 and Th2 cells were counted by flow cytometry. ELISA was used to detect the levels of inflammation-associated factors TNF-α, IL-6 and IL-1β in the serum. Results Compared with the vehicle group, the ankle swelling and limitation of joint activity in the PSO group were significantly reduced, the spleen index and Th1 cell percentage were significantly decreased, and the Th2 cell percentage showed no significant change in the PSO group. Expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum was notably decreased in the PSO group. All the indexes showed no significant difference between the PSO and MTX groups. Conclusions Psoralen may attenuate the severity of type II collagen-induced rheumatoid arthritis in mice by regulating the balance of Th1/Th2 cells and inhibiting the expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β.

Psoralen; Rheumatoid arthritis; Mouse model; Inflammatory factor; Th1/Th2; Immunoregulation

CHEN Zhao-yang，E-mail: ccytycn@163.com

山西省實驗動物專項資金項目(2009k03,2013k12)；山西省重點實驗室建設(shè)項目(2015012001-09)。

張引紅(1972-), 女, 碩士，實驗師, 研究方向:實驗動物學(xué)。E-mail: sxndzyh@163.com

陳朝陽(1972-), 男,副教授, 主要研究方向:實驗動物學(xué)。E-mail: ccytycn@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0207-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.017

2016-11-17