姚剛,李強,付雷,葉仕根,黎睿君,李華

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

幾種中草藥對刺參幼參的急性毒性試驗

姚剛,李強,付雷,葉仕根,黎睿君,李華

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

為探究刺參Apostichopus japonicus對中草藥的毒性反應(yīng),在水溫13～15℃下采用水生生物急性毒性試驗方法對體質(zhì)量為(2.36±0.41)g的刺參幼參進行了5種中草藥急性毒性試驗。結(jié)果表明:單方中草藥對刺參幼參的毒性大小依次為五倍子＞烏梅＞石榴皮＞黃芩＞甘草;五倍子、烏梅、石榴皮、黃芩和甘草對刺參幼參的48 h半致死濃度分別為0.340、2.027、2.149、2.234、4.900 g/L,安全濃度分別為0.055、0.272、0.166、0.271、0.605 g/L;6組復(fù)方藥物中毒性最大的是五倍子+甘草,其次是五倍子+黃芩、甘草+黃芩、石榴皮+五倍子,烏梅+石榴皮、五倍子+烏梅兩組復(fù)方的毒性最低。研究表明,在安全濃度范圍內(nèi),單方中草藥五倍子、烏梅,復(fù)方五倍子+烏梅、石榴皮+烏梅可用作刺參細菌性疾病的防治藥物。

中草藥;刺參;急性毒性;烏梅;五倍子;石榴皮;黃芩;甘草

刺參Apostichopus japonicus是中國北方沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟養(yǎng)殖品種,2014年中國海參養(yǎng)殖面積達26.39萬hm2,養(yǎng)殖產(chǎn)量達20.97萬t(主要為刺參),產(chǎn)值超過200億元[1],產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴張以及生產(chǎn)過程中的不規(guī)范操作,養(yǎng)殖刺參發(fā)生了多種疾病,其主要病因為細菌感染[2-8],表現(xiàn)為化皮、排臟等癥狀。目前,針對這些疾病的防治主要依賴于消毒劑和抗生素類藥物,然而抗生素易產(chǎn)生殘留,影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全,因此,研發(fā)綠色、無公害的防治藥物具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的發(fā)展前景。

中草藥具有提高魚類免疫力和促進生長的雙重功效,且部分中草藥本身具有抗菌能力,病原微生物一般不會對其產(chǎn)生抗藥性[9]。因中草藥具有天然性、毒副作用小、無殘留、無抗藥性[10]等優(yōu)點,被視為抗生素的替代品,受到國內(nèi)外科研工作者的重視。

關(guān)于中草藥在刺參疾病防治中的研究報道較少。李華等[11]報道了幾種中草藥對海水養(yǎng)殖中常見病原菌的抗菌作用;王印庚等[5]開展了中草藥對刺參腐皮綜合征病原菌的體外抑菌試驗;吳亞楠等[12]進行了復(fù)方中草藥對刺參免疫力和抗病力影響的研究;丁鑒鋒等[13]將復(fù)方中草藥作為飼料添加劑,研究其對幼參的免疫機制。而有關(guān)刺參對中草藥的毒性反應(yīng)研究目前尚未見報道。

本試驗中,通過前期體外抑菌試驗,在篩選獲得了具有明顯抑菌作用的5種單方藥和6種復(fù)方藥的基礎(chǔ)上,于13～15℃下進行了對刺參幼參的急性毒性試驗,旨在探索刺參對中草藥的毒性反應(yīng)及其安全濃度,為中草藥應(yīng)用于刺參疾病防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中草藥,均購于大連奇運生藥店,經(jīng)過實驗室的前期體外抑菌殺菌試驗[11],從10種中草藥中篩選出具有較強殺菌能力的5種中草藥分別為五倍子、石榴皮、黃芩、烏梅、甘草。

試驗用刺參購于大連灣某海參養(yǎng)殖場,體長為3～5 cm,體質(zhì)量為(2.36±0.41)g,在60 cm×30 cm×40 cm玻璃水族箱內(nèi)暫養(yǎng),養(yǎng)殖用水為大連市黑石礁海域沙濾海水,鹽度為29～32,pH為7.9～8.3,水溫為13～15℃。暫養(yǎng)期間不間斷充氧,每日投飼、換水。

1.2 方法

1.2.1 中草藥藥液的煎制 將上述5種中草藥各取(五倍子去蟲尸)20 g分別加水200 mL,浸泡0.5 h后煎煮沸騰轉(zhuǎn)文火煮0.5 h,過濾煎液,將藥物殘渣繼續(xù)煎煮,共煎煮3次,合并濾液,濃縮至1 g/mL含藥量,于冰箱(4℃)中保存(48 h內(nèi)使用)。

1.2.2 單方藥中草藥對刺參的急性毒性試驗

(1)10倍倍比稀釋法。將上述藥物用滅菌海水進行10倍倍比稀釋(10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L、100 g/L),進行藥物的急性毒性試驗。每個藥物濃度下取刺參3頭,在2 L聚乙烯燒杯內(nèi)浸浴給藥24 h后,找出大致致死濃度范圍,試驗期間保持充氧,水溫為13～15℃。

(2)2倍倍比稀釋法。在2倍倍比稀釋的中草藥物各濃度(在步驟(1)中的大致范圍內(nèi))下,取4頭刺參,浸浴給藥24 h后,記錄死亡結(jié)果,試驗條件同上,確定最高死亡率濃度LCmax和最低死亡率濃度LCmin。

(3)改良寇氏法。通過預(yù)試驗確定正式試驗時最高死亡率和最低死亡率的濃度范圍,據(jù)此確定正式試驗的具體分組試驗方案,按照下式求算組間距(i值)為

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,石榴皮、烏梅、黃芩和甘草分別按等對數(shù)間距設(shè)置6個濃度組,五倍子設(shè)置10個濃度組,并設(shè)不添加中草藥的對照組,每組設(shè)置2個平行,每組放養(yǎng)幼參10頭,浸浴給藥24、48、72 h時,觀察并記錄刺參的健康狀況和死亡情況,采用“改良寇氏法”計算出48 h的半致死濃度LC50(g/L)和藥物的安全濃度SC (g/L)[14-15],濃度設(shè)置見表3。

其中:Xm為最大濃度的常用對數(shù);P為各組動物的死亡率,以小數(shù)表示;∑P為各組動物死亡率的總和;i為相鄰兩組濃度(LC)常用對數(shù)值之差(高濃度為分子),或相鄰兩組濃度之差。

1.2.3 復(fù)方藥中草藥對刺參的急性毒性試驗 上述5種單方中草藥經(jīng)實驗室前期體外聯(lián)合藥敏實驗[11],篩選出6組抑菌殺菌效果較強的復(fù)方藥物,分別為五倍子+烏梅、五倍子+黃芩、黃芩+甘草、石榴皮+烏梅、五倍子+石榴皮、五倍子+甘草。其中,每一組復(fù)方設(shè)置兩個濃度組,每個濃度組設(shè)置兩個平行,每組放養(yǎng)10頭幼參,試驗時間為48 h。濃度的設(shè)置為

2 結(jié)果與分析

2.1 單方中草藥對刺參的急性毒性

2.1.1 10倍倍比稀釋法 黃芩、烏梅、甘草、五倍子、石榴皮的10倍倍比稀釋的藥物濃度對刺參急性毒性預(yù)試驗結(jié)果表明,五倍子的毒性較大,對刺參的致死濃度范圍為0.1～1.0 g/L;黃芩、烏梅、石榴皮、甘草的毒性較小,對刺參的致死濃度范圍為1～10 g/L(表1)。

表1 中草藥對刺參的急性毒性預(yù)試驗結(jié)果(10倍倍比稀釋)Tab.1 Toxicity of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicusby 10 times'grade in a pretest

2.1.2 2倍倍比稀釋法 黃芩、烏梅、甘草、五倍子、石榴皮的2倍倍比稀釋的藥物濃度對刺參急性毒性預(yù)試驗結(jié)果表明,五倍子對刺參的毒性較大,其對刺參的致死濃度范圍為0.1～0.8 g/L,甘草的毒性最小,黃芩、烏梅、甘草、石榴皮,其對刺參的致死濃度范圍為1～8 g/L(表2)。

表2 中草藥對刺參的急性毒性預(yù)試驗結(jié)果(2倍倍比稀釋)Tab.2 Toxicity of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicusby double's grade in a pretest

2.1.3 改良寇試法 單方中草藥對刺參的急性毒性試驗結(jié)果及48 h半致死濃度和安全濃度見表3,刺參表現(xiàn)出的毒性癥狀見圖1。

黃芩:隨著黃芩濃度的逐漸升高,其對刺參毒性逐漸變大,濃度大于等于2.40 g/L時,刺參72 h的死亡率達到100%。與其他中草藥組相比,黃岑組體色接近于健康刺參的體色,而高濃度組部分刺參則出現(xiàn)背部疣足潰爛、局部化皮(圖1-A)等癥狀。黃芩對刺參的48 h半致死濃度和安全濃度分別為2.234、0.271 g/L。

表3 中草藥對刺參的急性毒性試驗Tab.3 Acute toxicity of Chinese herbal medicins to sea cucumberApostichopus japonicusin the experiment

烏梅:在施藥后的前24 h,刺參表現(xiàn)出身體收縮,未見化皮癥狀。大部分刺參隨時間的延長逐漸恢復(fù),而高濃度組隨作用時間的延長,個別刺參體壁呈現(xiàn)白色增生(圖1-B),這些參48 h后死亡。烏梅對刺參的48 h半致死濃度和安全濃度分別為2.027、0.272 g/L。

甘草:刺參不適癥狀主要表現(xiàn)為化皮、萎縮、排臟,其中排臟現(xiàn)象嚴重,除3.50、4.17 g/L濃度組外,其他組刺參全部排臟(圖1-C),死亡時最明顯特征為身體透明化。甘草對刺參的48 h半致死濃度和安全濃度分別為4.900、0.605 g/L。

五倍子:各濃度組刺參均出現(xiàn)排便量增多的現(xiàn)象,瀕死刺參體色微白、體壁變硬,未出現(xiàn)化皮、排臟癥狀(圖1-D)。死亡刺參個體體色發(fā)白、背部疣足突出。五倍子對刺參的48 h半致死濃度和安全濃度分別為0.340、0.055 g/L。

石榴皮:試驗組刺參體色較正常,極個別個體出現(xiàn)排臟現(xiàn)象,高濃度組個別刺參出現(xiàn)輕度化皮癥狀(圖1-E)。石榴皮對刺參的48 h半致死濃度和安全濃度分別為2.149、0.166 g/L。

2.2 復(fù)方中草藥對刺參的急性毒性

復(fù)方中草藥對刺參的急性毒性試驗結(jié)果表明:濃度1復(fù)方藥物對刺參均未引起明顯的變化,致死率均為0;濃度2復(fù)方藥對刺參的急性毒性效果不同,五倍子+烏梅、烏梅+石榴皮復(fù)方組刺參體壁出現(xiàn)白色增生,五倍子+黃芩、石榴皮+五倍子的復(fù)方組刺參背部疣足突出且體壁變硬,甘草+黃芩、五倍子+甘草復(fù)方組刺參出現(xiàn)排臟和身體僵硬,而未出現(xiàn)化皮癥狀。本試驗中刺參的死亡率表明,毒性最低的復(fù)方組為烏梅+石榴皮、五倍子+烏梅,致死率均為30%,其次為五倍子+黃芩、甘草+黃芩、石榴皮+五倍子,毒性最大組為五倍子+甘草,致死率達80%(表4)。

圖1 刺參對不同中草藥所表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)Fig.1 The toxic reactions of sea cucumberApostichopus japonicusexposed to Chinese herbal medicines

表4 復(fù)方中草藥對刺參的急性毒性試驗Tab.4 Acute toxicity of complex prescription of Chinese herbal medicines to sea cucumberApostichopus japonicus

3 討論

3.1 單一中草藥對刺參的毒性

5種中草藥對刺參的急性毒性試驗結(jié)果表明,單方中草藥對刺參幼參的毒性大小依次為:五倍子＞烏梅＞石榴皮＞黃芩＞甘草。

五倍子對包括刺參病原在內(nèi)的其他海水病原菌的抗菌效果最好[11],且作為外用中草藥具有較好的創(chuàng)面修復(fù)功能[16],在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛使用[17]。然而在本試驗中,五倍子則表現(xiàn)出對刺參的毒性最強,當(dāng)高濃度時,其對刺參毒性主要是導(dǎo)致身體僵硬,可阻止刺參化皮癥狀的產(chǎn)生,這與五倍子有較強的收斂和凝固蛋白作用有關(guān)。有研究表明,五倍子主要成分為鞣質(zhì),含量達60%～80%,其能使皮膚、黏膜和潰瘍的組織蛋白凝固,形成一層被膜,具有收斂、減少滲出作用[18-19]。當(dāng)刺參受到感染或應(yīng)激反應(yīng)時,出現(xiàn)最多的癥狀則是化皮,因此,五倍子較好的抗菌功效和較強的收斂和凝固蛋白作用,正是預(yù)防和治療刺參“化皮病”的理想藥物,對其合理、謹慎配伍和使用非常重要。姚敬明等[20]等通過對小白鼠注射五倍子、石榴皮中提取的鞣質(zhì)溶液進行毒性試驗,結(jié)果顯示,提取的這兩種鞣質(zhì)溶液均對小白鼠有毒性,且五倍子毒性要大于石榴皮,這與本試驗結(jié)果基本一致。

烏梅具有收斂固澀、抗氧化等作用。有關(guān)烏梅對動物的毒性試驗研究較少,而對人體的臨床應(yīng)用較多。王璐等[21]進行了烏梅及其炮制品對大鼠長期毒性試驗,結(jié)果顯示,烏梅及其炮制品對大鼠未出現(xiàn)毒性反應(yīng),血液等指標也未發(fā)現(xiàn)異常。但本試驗研究發(fā)現(xiàn),烏梅在高濃度下對刺參顯示出一定的毒性作用,個別刺參體壁出現(xiàn)增生現(xiàn)象,這可能與不同物種有關(guān)。烏梅果實富含有機酸(如檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等)、萜類、甾醇、氨基酸、糖類、黃酮類、生物堿、微量元素(Fe、Mg、Cu等)[22]。烏梅的收斂作用,可導(dǎo)致刺參身體收縮,但并未出現(xiàn)化皮,其抗菌活性較強[11],可作為防治刺參細菌性疾病的理想藥物。

石榴皮中含鞣質(zhì)、石榴皮堿、異槲皮苷、樹脂、甘露醇、沒食子酸等,并含多種氨基酸和微量元素[23],低濃度石榴皮提取液對刺參未造成明顯的生理變化,但浸浴在高濃度提取液時,刺參出現(xiàn)化皮的現(xiàn)象,這與郭新慧等[24]研究發(fā)現(xiàn)的石榴皮醇提物能夠引起小鼠肝臟的急性損傷,且毒性隨濃度增大而加強的結(jié)果相近。筆者認為,石榴皮雖含有具收斂作用的鞣質(zhì),但其含量相對五倍子較低,且石榴皮中含有較多其他成分,如石榴皮堿、異槲皮苷、沒食子酸等,這可能是導(dǎo)致高濃度石榴皮提取液可造成刺參化皮的原因之一,在刺參養(yǎng)殖中應(yīng)謹慎使用。

有研究表明,黃芩水煎液、醇提液對小鼠的毒性較低,具有較好的安全性,臨床應(yīng)用安全可靠[25]。本試驗中,黃芩提取液對刺參的48 h半致死濃度為2.234 g/L,安全性也相對較好,但高濃度的黃芩提取液對刺參具有致死作用,且與五倍子和烏梅不同,刺參背部疣足出現(xiàn)潰爛,局部出現(xiàn)化皮癥狀,故在刺參疾病防治中不提倡單獨使用黃芩。

本試驗中,甘草對刺參48 h半致死濃度為4.900 g/L,毒性較小,與程艷芹等[26]發(fā)現(xiàn)甘草提取液對小鼠急性毒性甚小的結(jié)果一致。甘草有效成分主要為三萜皂苷類化合物等[27],一般認為,其對哺乳類動物的口服毒性很低,但對冷血動物具有一定毒性,本試驗結(jié)果也顯示,高濃度的甘草提取液能夠?qū)е麓虆⑺劳?。但試驗中甘草在水體中存留時間過長時,會導(dǎo)致水體發(fā)臭,引起刺參化皮,導(dǎo)致大量排臟,故不建議在刺參疾病治療中使用。

3.2 復(fù)方中草藥對刺參的毒性

復(fù)方中草藥對刺參的急性毒性試驗結(jié)果表明:配伍后,除五倍子+甘草組毒性明顯增強,其他配伍組如烏梅+石榴皮、五倍子+烏梅、五倍子+黃芩、甘草+黃芩、石榴皮+五倍子的毒性無顯著性差異,配伍之后毒性均有所降低。

通過對復(fù)方甘草+五倍子與單方甘草、五倍子藥效的比較發(fā)現(xiàn),從刺參外觀癥狀來看,復(fù)方組刺參未出現(xiàn)化皮癥狀,而單方甘草組刺參表現(xiàn)出化皮癥狀,分析原因是由于復(fù)方藥物中五倍子含有的鞣質(zhì)起到了收斂、減少滲出作用,阻止了刺參化皮;從刺參死亡情況分析,復(fù)方組在單方甘草、五倍子組的平均半致死濃度下對刺參造成的致死率達到80%,高于理論累加致死率50%,可能是由于五倍子和甘草配伍時產(chǎn)生了協(xié)同作用,使甘草中主要成分三萜皂苷類化合物的作用效果被增大,導(dǎo)致其對刺參的刺激增大,造成刺參排臟,故不提倡使用復(fù)方五倍子+甘草制劑。

復(fù)方烏梅+石榴皮、五倍子+烏梅、五倍子+黃芩、甘草+黃芩、石榴皮+五倍子在平均半致死濃度時對刺參造成的致死量均比理論累加致死量(死亡10頭)低,其中復(fù)方烏梅+石榴皮、五倍子+烏梅組,配伍減毒效果最明顯,致死率僅為30%,這可能是因配伍藥物的有效成分互相結(jié)合產(chǎn)生拮抗作用,使其轉(zhuǎn)化為毒性較低的物質(zhì),從而達到配伍減毒的結(jié)果。

綜上所述,在安全濃度之下,單方中草藥五倍子、烏梅,復(fù)方五倍子+烏梅、石榴皮+烏梅均可用于刺參細菌性疾病的防治。

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Acute toxicity of several Chinese herbal medicines to juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

YAO Gang,LI Qiang,FU Lei,YE Shi-gen,LI Rui-jun,LI Hua
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Acute toxicity of 5 kinds of Chinese herbal medicines to juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus with body weight of(2.36±0.41)g was studied at water temperature of 13-15℃by an ordinary method to evaluate toxic effects of Chinese herbal medicine on sea cucumber.It was found that toxicity of single Chinese herbal medicine was descendantly arranged as Galla chinensis,Fructus mume,Pericarpium granati,Radix scutellariae and Glycyrrhiza uralensis fisch,with the 48 hours medial lethal concentration(LC50)of 0.340,2.027,2.149,2.234 and 4.900 g/L,and with safe concentration of 0.055,0.272,0.166,0.271,and 0.605 g/L,respectively.The maximal toxicity of 6 kinds of Chinese herbal medicine compounds was found in compound Galla chinensis+Glycyrrhiza uralensis fisch,followed by Galla chinensis+Radix scutellariae,Glycyrrhiza uralensis fisch+Radix scutellariae, and Pericarpium granati+Galla chinensis,and the minimal toxicity in two compound groups compound of Galla chinensis+Fructus mume,and compound of Fructus mume+Pericarpium granati.The findings suggested that Galla chinensis,Fructus mume and compound of Galla chinensis+Fructus mume,Fructus mume+Pericarpium granati,and be used in control and prevention of sea cucumber diseases.

Chinese herbal medicine;Apostichopus japonicus;acute toxicity;Fructus mume;Galla chinensis; Pericarpium granati;Radix scutellariae;Glycyrrhiza uralensis fisch

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.007

2095-1388(2017)02-0161-06

S948;S91

:A

2016-12-22

國家海洋公益行業(yè)專項(201405003);國家“星火計劃”項目(2015GA650006);遼寧省海洋漁業(yè)廳重點攻關(guān)項目(201402)

姚剛(1988—),男,碩士研究生。E-mail:yaogang0185@163.com

李強(1979—),男,博士,教授。E-mail:liqiang@dlou.edu.cn