尹昌善， 張立霞， 薛書江， 宋建臣， 李海峰， 許應(yīng)天*

(1.和龍市動物檢疫站,吉林 和龍 133500;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

延邊黃牛γ-干擾素基因的克隆與序列分析

尹昌善1， 張立霞2， 薛書江2， 宋建臣2， 李海峰2， 許應(yīng)天2*

(1.和龍市動物檢疫站,吉林 和龍 133500;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

應(yīng)用刀豆素蛋白(ConA)和植物分裂素( PHA) 雙重誘導(dǎo)培養(yǎng)延邊黃牛脾淋巴細(xì)胞，提取脾淋巴細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增延邊黃牛γ-干擾素基因，并將其克隆到pMD-18-T simple載體中，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定及測序。結(jié)果表明：成功克隆了462 bp大小的延邊黃牛γ-干擾素基因片段；所克隆基因片段序列與歐洲牛、印度牛的親緣關(guān)系最近，同源性分別為99.8%和99.6%，與歐洲牛的氨基酸同源性為100%。本試驗為進(jìn)一步研究延邊黃牛γ-干擾素生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

延邊黃牛；γ-干擾素基因；克隆；序列分析

干擾素( interferon，IFN) 是主要由NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生的一類功能調(diào)節(jié)蛋白，具有抑制細(xì)胞分裂、廣譜抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等功能[1]。自Cerrett[2]等于1986年首先克隆出乳牛IFN-γ基因后，就受到廣泛關(guān)注，干擾素生物制劑的開發(fā)應(yīng)用已成為研究熱點[3-9]，但至今尚未有關(guān)于延邊黃牛IFN-γ基因的相關(guān)報道。

本試驗旨在克隆延邊黃牛IFN-γ基因，為今后進(jìn)一步研究IFN-γ 對提升延邊黃牛的抗病能力及免疫佐劑作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

脾淋巴細(xì)胞從延吉市興隆牧場健康延邊黃牛脾臟無菌分離制備。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和Hand Ⅲ、Ex-Taq DNA聚合酶、牛淋巴細(xì)胞分離液、DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、M-MLV鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、Marker(DL-2000)、RNA小量提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4連接酶pMD-18-T simple 載體和感受態(tài)E.coliBL21,均購自大連寶生物公司；ConA、PHA、胎牛血清(FBS)、RPMI1640,均購自Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank登錄的牛IFN-γ基因序列(登錄號為M29867)設(shè)計1對引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物F：5′-GCGGATCCGCTTTACTGCTCTGTGGGCT-3′ BamHⅠ

下游引物R：5′-GCAAGCTTTCTGACTTCTCTTCCGCTTTC-3′ Hand Ⅲ

1.4 脾淋巴細(xì)胞的分離與活化

按說明書分離脾淋巴細(xì)胞，將PHA(1.5 μg/mL)、ConA(30 μg/mL)、FBS(10%)、L-谷氨酰胺(2 mmol/L)、(100×)雙抗(青霉素和鏈霉素)加入到RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。取適量細(xì)胞至100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，放CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)36 h。

1.5 總RNA的提取及RT-PCR

將細(xì)胞總RNA 8 μL、1 μL 50 μM的通用引物Oligo(dT)18和DEPC水1 μL混勻，70 ℃水浴10 min，迅速冰浴2 min，瞬離。在上述10 μL溶液中加入dNTP Mixture(各10 mM)2 μL、5×M-MLV Buffer4 μL、1 μL RTase M-MLV(200 U/μL)、0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)、2.5 μL DEPC水，42 ℃水浴1 h，70 ℃水浴15 min，冰浴備用。

1) 25 μL PCR擴(kuò)增體系：Ex-Taq DNA聚合酶0.15 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，DEPC水16.35 μL。

2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增后，取PCR產(chǎn)物，凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.6 目的基因的克隆

回收PCR產(chǎn)物，與pMD-18-T simple載體16 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞。涂板，培養(yǎng)，挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌過夜，質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性質(zhì)粒。

1.7 陽性質(zhì)粒的鑒定及測序

將提取的質(zhì)粒進(jìn)行Hand Ⅲ和BamHⅠ雙酶切鑒定和PCR鑒定，并將鑒定為陽性的克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。利用DNAStar軟件，進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 延邊黃牛IFN-γ基因的RT-PCR擴(kuò)增

從PHA和ConA雙重誘導(dǎo)的牛脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增，獲得1條462 bp的特異條帶，結(jié)果與預(yù)期目的片段相符(圖1)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定

重組克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和BamHⅠ、Hand Ⅲ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳后，得到了與預(yù)期大小一致的特異性片段(圖2)。

圖2 pMD-18-IFN-γ的PCR和酶切鑒定圖譜

2.3 序列測定與分析

用DNAStar軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析，結(jié)果無論在核苷酸還是在氨基酸水平，所得序列與其它動物的IFN-γ基因序列之間均有較高同源性(圖3)，即同種之間同源性很高，其中，與歐洲牛的氨基酸同源性為100%；與反芻獸之間同源性也較高，均高于95%以上，而與犬屬動物的同源性最低。

由圖4可知，延邊黃牛IFN-γ基因與歐洲牛、印度牛處在同一進(jìn)化分支，延邊黃牛與歐洲牛的親緣關(guān)系最近，與犬的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 IFN-γ基因序列和氨基酸序列的同源性比較

圖4 IFN-γ基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

延邊黃牛是吉林省延邊朝鮮族自治州地區(qū)役肉兼用黃牛品種，是中國5大地方良種牛之一，是中國畜禽品種基因庫中極其珍貴的財富。因延邊黃牛品種特征和肉品特性優(yōu)良，具有鮮明的地域特色，成為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。延邊黃牛的肉質(zhì)品味獨(dú)具特色，而且肉質(zhì)明顯優(yōu)于其它牛肉，特別是有益于人體健康的不飽和脂肪酸、油酸含量明顯高于其它牛[10]。但由于經(jīng)貿(mào)活動的頻繁，延邊黃牛相繼發(fā)生各種疫病，嚴(yán)重影響延邊黃牛業(yè)的迅速健康發(fā)展。干擾素(interferon，IFN) 是主要由 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞產(chǎn)生的一類功能調(diào)節(jié)蛋白，具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞分裂及免疫調(diào)節(jié)等功能。因此，開展本研究成功克隆了延邊黃牛IFN-γ基因。

目前，在克隆細(xì)胞因子基因時，大多用ConA[11]、PHA[12]和LPS[13]等誘導(dǎo)劑，也有報道無需用誘導(dǎo)劑[14]。認(rèn)為這可能與不同組織中目的基因含量多少有關(guān)。綜合考慮本研究采用了ConA和PHA雙重誘導(dǎo)方法，從脾淋巴細(xì)胞中成功克隆出延邊黃牛IFN-γ基因。

通過對延邊黃牛IFN-γ基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，無論從核苷酸序列還是氨基酸序列來看，所克隆的延邊黃牛IFN-γ基因與歐洲牛、印度牛、羊和綿羊等反芻獸有較高的同源性(95%以上)，與歐洲牛的氨基酸同源性高達(dá)100%，而與其他種動物之間差異較大。說明牛γ-干擾素沒有品種特異性，但有種特異性。該結(jié)果與熊毅等報道的基本一致[3]。

本研究是延邊黃牛IFN-γ生物學(xué)功能研究的前期工作。這次成功克隆了延邊黃牛IFN-γ基因，為今后進(jìn)一步將延邊黃牛IFN-γ用于延邊黃牛疫病防治奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and sequence analysis of IFN-γ gene in Yanbian bovine

YIN Changshan1, ZHANG Lixia2， XUE Shujiang2， SONG Jianchen2， LI Haifeng2， XU Yingtian2*

(1.AninalQuaraneineStationofHelongCity,HelongJilin133500,China;2.AgricultralCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

The Yanbian cattle IFN-γ gene was amplified by RT-PCR from total RNA of Yanbian cattle spleen lymphocytes double induced and cultured by ConA and PHA. IFN-γ gene was cloned into PMD-18-T simple vector,and operated on PCR identification and restriction enzyme digestion and sequencing. The results showed that Yanbian cattle IFN-γ gene was successfully cloned; The Yanbian cattle IFN-γ gene was closest with European cattle IFN-γ gene and Indian cattle IFN-γ gene in genetic relationship, and the homology of genetic sequence were 99.8% and 99.6%. In addition, the homology of amino acid was 100% between Yanbian cattle IFN-γ gene and European cattle IFN-γ gene. The experiment laid the foundation for the further study of biological effects of Yanbian cattle IFN-γ.

Yanbian cattle；IFN-γ gene；clone；sequence analysis

2017-01-15 基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(吉教科合字[2015]第16號)

尹昌善(1962—)，男(朝鮮族)，吉林和龍人，高級獸醫(yī)師，研究方向為動物檢疫，許應(yīng)天為通信作者，E-mail：ytxu@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0083-04

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.015

S823

A