敖維平　張蕾　周東年　盛鶴

摘要：為篩選降解棉籽粕大分子蛋白有效菌株，試驗(yàn)選用假絲酵母菌（1630）、米曲霉（2174）、黑曲霉（2377）、混合菌（假絲酵母菌：米曲霉：黑曲霉=1：1：1）進(jìn)行棉籽粕滅菌和未滅菌固體發(fā)酵。分別采用微量凱氏定氮法、甲醛滴定法測定棉籽粕發(fā)酵產(chǎn)品的酸溶蛋白氮、游離氨基氮，比較棉籽粕發(fā)酵產(chǎn)品的小分子肽氮含量、小分子肽氮提高率。結(jié)果表明，選用3株標(biāo)準(zhǔn)菌種及其混合菌液對(duì)棉粕發(fā)酵處理均可降解大分子棉蛋白，且混合菌株發(fā)酵表現(xiàn)出“協(xié)作效應(yīng)”；由反映發(fā)酵棉蛋白特性的酸溶蛋白總氮、游離氨基氮、小肽含量可知，單菌株及混合菌株發(fā)酵處理時(shí)間以48 h為宜。

關(guān)鍵詞：棉籽粕；酸溶蛋白氮；游離氨基氮；小分子肽氮

中圖分類號(hào)：S816.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0366—03

棉粕是我國飼料工業(yè)中一種重要的蛋白質(zhì)原料，常年生產(chǎn)量超過600萬t，粗蛋白含量僅低于豆粕，但棉粕含游離棉酚、蛋白質(zhì)品質(zhì)差等不利因素限制了其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用。對(duì)棉籽粕的開發(fā)利用中不僅要降低棉粕游離棉酚，提高棉粕蛋白質(zhì)品質(zhì)也極為重要。國內(nèi)外學(xué)者采用有效菌種發(fā)酵改良棉粕營養(yǎng)特性，并取得了一定進(jìn)展，發(fā)酵降低棉粕游離棉酚的研究較多，而關(guān)于發(fā)酵后棉粕蛋白質(zhì)品質(zhì)改良的研究仍有待深入。隨著動(dòng)物營養(yǎng)研究的深入開展，小肽營養(yǎng)逐漸成為動(dòng)物營養(yǎng)的研究熱點(diǎn)，利用低質(zhì)飼料蛋白原料生產(chǎn)小分子營養(yǎng)肽備受關(guān)注，發(fā)酵法也成為降低蛋白分子質(zhì)量、提高棉蛋白品質(zhì)的有效方法。本研究選用黑曲霉、假絲酵母菌、米曲霉、混合菌液固體發(fā)酵降解棉粕，并分析棉粕發(fā)酵降解后的蛋白質(zhì)組成特性，以期為棉粕在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的合理利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

棉籽粕購自新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市某油脂廠，經(jīng)粉碎過40目篩，作為發(fā)酵基礎(chǔ)原料。假絲酵母菌（1630）、米曲霉（2 174）、黑曲霉（2 377）標(biāo)準(zhǔn)菌種均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。PDA液體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200 g/L、蔗糖20 g/L，pH值自然；LB液體培養(yǎng)基配方為：酵母膏5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子液的制備 取超低溫保存的菌種置于37℃使其解凍，挑取菌落并接種于液體培養(yǎng)基中，置于37℃使其復(fù)活，取復(fù)活的菌落進(jìn)行2次以上斜面培養(yǎng)，獲得斜面菌種。

假絲酵母菌：取1環(huán)活化并經(jīng)培養(yǎng)的斜面菌種接于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，取2 mL轉(zhuǎn)接至另一LB液體培養(yǎng)基，并于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h作為種子液。黑曲霉與米曲霉：取1環(huán)斜面菌種接于放有20顆玻璃株的PDA液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，取2 mL轉(zhuǎn)接至另一PDA液體培養(yǎng)基，并于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵種子液。

1.2.2棉籽粕發(fā)酵處理 稱取棉粕50 g置于500 mL三角瓶，按料水比1 g：1 mL充分?jǐn)噭颍糜?21℃高溫高壓滅菌30 min。試驗(yàn)發(fā)酵分為未滅菌發(fā)酵、滅菌發(fā)酵，分別接種酵母菌、黑曲霉、米曲霉、混后菌（酵母菌：黑曲霉：米曲霉=1：1：1），接種量均為100 g/L，對(duì)照組（0 h）以重蒸水代替菌液，分別于發(fā)酵24、48、72 h時(shí)取樣，置于60℃烘箱12 h后，粉碎并過60目篩，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3指標(biāo)測定 稱取過60目篩的發(fā)酵棉籽粉5 g，加入70 mL水并于恒溫振蕩器振蕩3 h，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，過濾并用體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸定容至100 mL，將濾液于4 000 r/min離心10 min，取上清液作為測定分析樣品。

發(fā)酵前棉粕蛋白氮、發(fā)酵棉粕酸溶蛋白總氮均采用凱氏定氮法測定；游離氨基氮采用甲醛滴定法測定。小分子肽氮含量（mg/g占干基）：酸溶蛋白氮與游離氨基氮之差。

小分子肽氮提高率=（發(fā)酵后小肽氮-發(fā)酵前小肽氮）×100%÷發(fā)酵前小肽氮。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS軟件進(jìn)行完全隨機(jī)單因素分析，采用LSD軟件進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1黑曲霉發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性

由黑曲霉發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性（表1）可知，發(fā)酵處理棉籽粕后，酸溶蛋白總氮、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于發(fā)酵前，且發(fā)酵48h時(shí)小肽氮含量均達(dá)到最大值，48 h后呈降低趨勢，這與李全豐等的研究結(jié)論相似。試驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉對(duì)滅菌、未滅菌的棉籽粕蛋白均有降解作用，且小分子肽氮含量顯著提高。

2.2假絲酵母發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性

由假絲酵母發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性（表2）可知，假絲酵母發(fā)酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于發(fā)酵前，而游離氨基氮?jiǎng)t呈降低趨勢，與黑曲霉發(fā)酵棉粕游離氨基氮的趨勢相反。試驗(yàn)結(jié)果表明，假絲酵母具有降解大分子棉蛋白的作用。

2.3米曲霉發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性

由米曲霉發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性（表3）可知，米曲霉發(fā)酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量均高于發(fā)酵前，并隨發(fā)酵時(shí)間的推移呈上升趨勢，但發(fā)酵48 h后呈下降趨勢；發(fā)酵棉蛋白的游離氨基氮較發(fā)酵前均減少。

2.4混菌發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性

由混菌發(fā)酵前后棉籽粕產(chǎn)品的蛋白質(zhì)特性（表4）可知，混合菌種發(fā)酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量均高于發(fā)酵前，并隨發(fā)酵時(shí)間的推移呈上升趨勢，但發(fā)酵48 h后呈降低趨勢；混菌發(fā)酵棉粕蛋白的小分子肽氮含量最佳，而游離氨基氮均低于發(fā)酵前。試驗(yàn)結(jié)果表明，混菌發(fā)酵降解棉粕大分蛋白的效果優(yōu)于單菌種發(fā)酵。

2.5不同菌種降解棉粕產(chǎn)生小分子肽的效果

由不同菌種降解棉粕大分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子肽的效果（圖1、圖2、表5）可知，采用3種菌株及其混合菌液發(fā)酵處理均可不同程度降解棉粕大分子蛋白質(zhì)，且滅菌發(fā)酵與未滅菌發(fā)酵的變化趨勢相似，除假絲酵母菌外，多以發(fā)酵48 h產(chǎn)生的小分子肽氮含量最多。然而菌種之間仍存在差異，以混菌發(fā)酵產(chǎn)生的小肽氮含量提高最為明顯，可見菌株混合發(fā)酵對(duì)降解棉粕大分子蛋白質(zhì)具有“協(xié)同效應(yīng)”，這與諸葛斌等的研究結(jié)論[2，4]一致。對(duì)單菌種的發(fā)酵效果進(jìn)行比較，米曲霉最佳，黑曲霉次之，假絲酵母最差。

3結(jié)論與討論

棉粕是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料之一，尤其在我國主要產(chǎn)棉地區(qū)。然而，產(chǎn)棉地區(qū)棉粕在畜禽飼料中的利用比例有限，這與棉粕游離棉酚的毒性、棉蛋白的吸收利用率有關(guān)。采用有益菌株發(fā)酵法降解不易被利用的棉粕大分子蛋白，提高可直接吸收利用的小肽含量，已成為提高棉蛋白消化吸收利用率的一種有效方法。本試驗(yàn)選用3種工業(yè)微生物標(biāo)準(zhǔn)菌種及其混合菌液固體發(fā)酵處理棉粕，酸溶蛋白總氮、小分子肽含量均大幅提高。綜合分析表明，3個(gè)菌株混合發(fā)酵的效果最佳，小分子肽氮可提高至6.37 mg/g（若蛋白系數(shù)取6.25，小肽含量可提高3.98%），比諸葛斌等的試驗(yàn)結(jié)果低，而比李旺軍等的試驗(yàn)結(jié)果高，這可能與發(fā)酵選用的菌株和發(fā)酵底物有關(guān)。本試驗(yàn)以單一棉粕為發(fā)酵底物，比較滅菌發(fā)酵與未滅菌發(fā)酵對(duì)降解棉粕大分子蛋白的效果。結(jié)果表明，發(fā)酵前未滅菌棉粕的小肽氮含量很低，僅為0.24 mg/g，而高溫滅菌使小肽氮含量提高至2.24 mg/g；高溫滅菌使酸溶蛋白總氮增加，而使游離氨基氮降低，可能由于高溫滅菌使部分大分子蛋白質(zhì)肽鍵斷裂而形成小分子肽，因游離氨基酸發(fā)生“美拉德反應(yīng)”導(dǎo)致游離氨基氮減少。比較滅菌與未滅菌發(fā)酵對(duì)小肽氮提高率的影響可知，未滅菌發(fā)酵降解棉粕大分子蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于滅菌發(fā)酵，但滅菌發(fā)酵的小肽氮含量較高。

試驗(yàn)采用3株標(biāo)準(zhǔn)菌種對(duì)棉粕發(fā)酵處理，均有降解大分子棉蛋白的作用，且混合菌株發(fā)酵表現(xiàn)出“協(xié)作效應(yīng)”。由反映發(fā)酵棉蛋白特性的酸溶蛋白總氮、游離氨基氮、小肽含量可知，單菌株及混合菌株的發(fā)酵處理時(shí)間以48 h為宜。