呂慶銀　趙偉　李岑　李雄　張振

摘要：先對(duì)臭常山的水分、總灰分、醇浸出物及其TLC、HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，明晰試驗(yàn)藥料的理化特征，然后采用超聲波輔助乙醇提取法對(duì)臭常山脂溶性生物堿的提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化。結(jié)果表明，本試驗(yàn)材料臭常山的水分、醇溶性浸出物、總灰分含量分別為8.21%、6.22%、6.20%；在單因素的基礎(chǔ)上，正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件為臭常山粗粉400 g，料液比1 g：20 mL，65%乙醇超聲提取80 min/次，超聲提取3次，脂溶性生物堿的提取率為0.385%。

關(guān)鍵詞：臭常山；指紋圖譜；脂溶性生物堿；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0279—04

蕓香科（Rutaceae）臭常山屬臭常山（Orixa japonica Thunb.），別稱日本常山、臭山羊，其主要化學(xué)成分為香豆素和喹啉類生物堿。目前關(guān)于其研究主要集中在所含化學(xué)成分方面，現(xiàn)從臭常山的根、莖、葉等部位分離到的已知喹啉類生物堿有：常山堿、香草木堿、茵芋堿、月蕓香酮堿、香草木堿、去甲和常山堿、加錫彌羅果堿、花椒毒素等。試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，這些化學(xué)成分中的一些喹啉類脂溶性生物堿具有抗肺炎克雷伯氏桿菌及金黃色葡萄球菌等抑菌活性。作為貴州民間中藥材，常用來(lái)治療風(fēng)熱感冒、咳嗽、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等病癥，其理化特征和提取工藝方面的研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。為富集其有效成分，在對(duì)試驗(yàn)臭常山理化特征進(jìn)行研究后，進(jìn)行有效成分的提取分離工藝研究，以期明確試驗(yàn)材料的理化特征，并獲得脂溶性生物堿的最佳提取工藝途徑，為推進(jìn)臭常山中藥現(xiàn)代化研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1試驗(yàn)材料

1.1材料與試劑

新鮮植物整株經(jīng)貴州大學(xué)茍光前教授鑒定為蕓香科植物臭常山（Orixajaponica Thunb.）；色譜乙腈及色譜甲醇（美國(guó)天地公司）、超純水（浙江杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司）；蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2儀器和設(shè)備

UltiMater^TM3000 DGLC雙三元液相色譜儀，富集柱（Ther-mo Fisher HyperSep Retain-CX，20 mm×3.0 mm），DAD檢測(cè)器，分析柱（Acclaim 120 PAⅡ，C₁₈，5μ×m，4.6 mm×250 mm），以上均為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；變色龍7.2工作站；SPJX-4-10型高溫箱式電阻爐（上海錦昱科學(xué)儀器有限公司）；WT5001電子天平（江蘇常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司）；ES-E210B電子分析天平（河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；潔康PS-100A超聲波清洗機(jī)（廣東東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵、RE-501升降恒溫水浴鍋、RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器及DLSB-10/20℃型低溫冷卻循環(huán)泵（均為上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司）；GF254硅膠板（山東青島海洋化工廠），ZF-2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）。

2試驗(yàn)方法

2.1材料預(yù)處理

將新鮮的臭常山整株截短、洗凈，然后晾干、粉碎，自然風(fēng)干后備用。

2.2臭常山水分、總灰分、醇浸出物的測(cè)定

水分含量測(cè)定采用中國(guó)藥典一部附錄ⅨH水分測(cè)定法項(xiàng)下的烘干法；醇浸出物測(cè)定采用藥典一部附錄Ⅹ A項(xiàng)下醇提取物熱浸法；灰分測(cè)定采用藥典附錄ⅨK項(xiàng)下的總灰分測(cè)定法。

2.3 TLC指紋圖譜

準(zhǔn)確稱取臭常山全株粗粉100 g，以1 g：5 mL的料液比加入70%乙醇，超聲提取30 min，過(guò)濾，濃縮，吸取少許濃縮液點(diǎn)于硅膠GF254板，以石油醚：丙酮=8：2為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，于紫外燈（257.5 am）下檢視。

2.4 HPLC指紋圖譜

2.4.1測(cè)試樣品制備 準(zhǔn)確稱取過(guò)二號(hào)篩的臭常山粉末2.408 9 g，加70%乙醇60 mL置250 mL錐形瓶中，密塞稱定質(zhì)量，靜置1 h，然后連接回流冷凝管，并保持微沸1 h，放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥過(guò)濾器過(guò)濾，取濾液過(guò)0.45μm針頭過(guò)濾器，即得測(cè)試樣品。

2.4.2對(duì)照品制備分別精確稱取月蕓香酮堿、香草木堿（實(shí)驗(yàn)室自制，純度>95%），加入甲醇后制成100μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.3色譜條件色譜柱為C₁₈（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（體積比1：1），體積流量1.00 mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)266 nm。

2.5脂溶性生物堿的制備及定量測(cè)定

（1）醇粗提物提取。準(zhǔn)確稱取臭常山粗粉400 g，4層紗布包裹，按試驗(yàn)所需的濃度和料液比加入乙醇進(jìn)行超聲提取，然后過(guò)濾，濾渣進(jìn)行重復(fù)提取，濾液濃縮成浸膏，干燥，即得粗提物。（2）脂溶性生物堿的制備和測(cè)定。取適量的2%HCl溶解上述浸膏，濾清酸水，等體積的乙酸乙酯萃取酸水3次，棄去乙酸乙酯層，25%氨水調(diào)節(jié)pH值為9～10，等體積氯仿萃取3次，合并氯仿層，濃縮，回收氯仿，殘留物即為脂溶性生物堿，干燥，稱質(zhì)量。

2.6脂溶性生物堿的定性檢測(cè)

生物堿的定性鑒定方法有很多，本試驗(yàn)采用碘化鉍鉀顯色法和薄層色譜法，具體方法如下：（1）取“2.5”節(jié)下制得的脂溶性生物堿3～5 mg，適量氯仿溶解；（2）毛細(xì)吸管吸取上述溶液點(diǎn)于硅膠GF254板上；（3）以石油醚-丙酮（8：2）為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，紫外燈（257.5 nm）下檢視；（4）噴碘化鉍鉀顯色液，晾干，日光下觀察；日光下有多個(gè)橘黃色或橙色斑點(diǎn)，紫外燈下有多個(gè)熒光亮點(diǎn)，即可判斷酸堿處理結(jié)合溶劑萃取后得到的是脂溶性生物堿。

3結(jié)果與分析

3.1試驗(yàn)用臭常山的水分、總灰分、醇浸出物含量比較

由表1可知，本試驗(yàn)用臭常山的7次測(cè)試樣品中，最高水分含量和最低水分含量相差0.07百分點(diǎn)，兩者相差不到0.1百分點(diǎn)，表明水分含量測(cè)定方法重復(fù)性良好；總灰分含量最高的為6.30%，最低的為6.11%，兩者相差0.19%，這可能是每次取樣量的多少不同，導(dǎo)致需要高溫?zé)胱频拇螖?shù)不同，而測(cè)試的精確度只需到0.01g，所以操作誤差相對(duì)會(huì)變大，試驗(yàn)重復(fù)性差些；70%醇浸出物含量最高的為6.27%，最低的為6.11%，兩者相差不到0.2百分點(diǎn)，醇浸出物含量測(cè)定穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

3.2指紋圖譜

3.2.1 TLC指紋圖譜 按上述“2.3”節(jié)的條件，毛細(xì)管分別吸取3次樣品溶液少許，點(diǎn)于同一塊GF254板上，對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行TLC指紋圖譜分析，結(jié)果（圖2）表明，同一樣點(diǎn)在以石油醚-丙酮（8：2）為展開(kāi)劑，經(jīng)展開(kāi)后得到了多個(gè)熒光點(diǎn)，表明此展開(kāi)體系適用于本樣品的TLC指紋圖譜構(gòu)建；且3次點(diǎn)樣得到的顯熒光點(diǎn)位置幾乎一致，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

3.2.2 HPLC指紋圖譜 按上述條件，對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。分別吸取對(duì)照品和供試品溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3至圖5。對(duì)照品香草木堿和月蕓香酮堿的保留時(shí)間分別為8 min左右和11.5 min左右，峰分離度好，峰形對(duì)稱。

3.2脂溶性生物堿提取的單因素試驗(yàn)

3.2.1乙醇濃度對(duì)脂溶性生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取臭常山粗粉400 g 5份，以料液比為1 g：10 mL，分別加入體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，超聲提取30 min，按“2.5”節(jié)下的方法對(duì)各組脂溶性生物堿進(jìn)行定性和定量測(cè)定，考察不同濃度的乙醇對(duì)脂溶性生物堿提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，脂溶性生物堿的提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)65%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，脂溶性生物堿的提取率反而隨之下降。這可能是因?yàn)榧?xì)胞在超聲破碎后，內(nèi)容物釋放到溶液中，脂溶性生物堿與其他內(nèi)容物之間在這個(gè)極性段共溶性較好。以體積分?jǐn)?shù)75%和85%的乙醇作為提取溶劑，脂溶性生物堿的提取率都比55%的大，因此通過(guò)此單因素試驗(yàn)，宜選擇體積分?jǐn)?shù)65%、75%、85%的乙醇作為正交試驗(yàn)中考察乙醇濃度影響的3個(gè)水平。

3.2.2超聲提取時(shí)間對(duì)脂溶性生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取5份臭常山粗粉各400 g，在料液比為1 g：10 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的條件下，分別超聲提取40、50、60、80、100 min，按“2.5”節(jié)下的方法對(duì)各組脂溶性生物堿進(jìn)行定性分析和定量測(cè)定，考察不同超聲提取時(shí)長(zhǎng)對(duì)脂溶性生物堿提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，臭常山脂溶性生物堿的提取率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)80 min時(shí)，再延長(zhǎng)時(shí)間脂溶性生物堿的提取率已變化不大，但超聲提取時(shí)長(zhǎng)100 min，其提取率由80 min的0.288%增加到0.295%，提取率只提高了0.007百分點(diǎn)，分析其可能原因是在超聲進(jìn)行到60 min時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始了大量破裂，細(xì)胞中所含生物堿大量釋放到提取液中?？紤]到工藝要節(jié)能省時(shí)，故不考察超聲提取100 min后繼續(xù)延長(zhǎng)超聲提取時(shí)長(zhǎng)的影響，所以正交試驗(yàn)在考察超聲提取時(shí)間對(duì)脂溶性生物堿提取率的影響時(shí)，只需考察60、80、100 min這3個(gè)水平。

3.2.3料液比對(duì)脂溶性生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取5份臭常山粗粉各400 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的條件下，分別以料液比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25（g：mL），超聲提取60 min，按“2.5”節(jié)下的方法對(duì)各組脂溶性生物堿進(jìn)行定性分析和定量測(cè)定，考察不同料液比對(duì)脂溶性生物堿提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，超聲提取過(guò)程中，脂溶性生物堿的提取率隨著提取過(guò)程中乙醇用量的增加而增大，當(dāng)料液比為1 g：15 mL時(shí)，隨著乙醇用量的增加，脂溶性生物堿的提取率提高并不大，這是因?yàn)榇蟛糠旨?xì)胞已經(jīng)破碎，細(xì)胞中脂溶性生物堿都已釋放到溶液中，考慮到乙醇用量的增大會(huì)增加耗能和增長(zhǎng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮浸膏的時(shí)間，耗能耗時(shí)，不符合工藝優(yōu)化的目的。因此通過(guò)此單因素試驗(yàn)，可以確定正交試驗(yàn)考察料液比對(duì)脂溶性生物堿提取率的影響時(shí)，料液比的選擇范圍應(yīng)在1 g：15 mL左右。

3.2.4超聲提取次數(shù)對(duì)脂溶性生物堿提取的影響 準(zhǔn)確稱取臭常山粗粉400 g，在料液比為1 g：10 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%的條件下，超聲提取60 min/次，分別提取1、2、3、4次，按“2.5”節(jié)下的方法對(duì)各組脂溶性生物堿進(jìn)行定性分析和定量測(cè)定，分別考察超聲提取次數(shù)對(duì)脂溶性生物堿提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，隨著超聲提取次數(shù)的增加，脂溶性生物堿的提取率亦在增大，當(dāng)超聲提取進(jìn)行1次時(shí)，脂溶性生物堿的提取率為0.28%，過(guò)濾后的藥渣進(jìn)行與第1次相同條件的重復(fù)提取，與第2次提取率相比，第3次提高了0.04百分點(diǎn)；第4次比第3次只提高了0.01百分點(diǎn)，所以在優(yōu)化臭常山脂溶性生物堿提取工藝過(guò)程中，在考察了乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比3個(gè)因素的正交試驗(yàn)后，將得到優(yōu)方案工藝進(jìn)行檢驗(yàn)，最后將優(yōu)方案工藝進(jìn)行3次超聲提取，即可達(dá)到試驗(yàn)的工藝優(yōu)化研究目的。

3.3脂溶性生物堿提取的正交試驗(yàn)

在考察了上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，臭常山脂溶性生物堿正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要考察的各因素與水平詳見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3。

從表3可知，影響臭常山脂溶性生物堿提取率的各因素的主次順序依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲提取時(shí)間>料液比，較優(yōu)方案是用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇、在料液比1 g：20 mL的條件下超聲提取80 min。因?yàn)榇朔桨冈谡辉囼?yàn)中沒(méi)有，故需進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。按照優(yōu)方案設(shè)計(jì)試驗(yàn)，超聲提取3次，結(jié)果得到臭常山脂溶性生物堿的提取率為0.385%。

4討論與結(jié)論

與一般文獻(xiàn)報(bào)道的生物堿提取工藝不同，由于中藥材植物的理化特征容易受到生長(zhǎng)地區(qū)、季節(jié)、年齡的影響，在進(jìn)行有效成分分離提取工藝前，首先對(duì)試驗(yàn)材料臭常山提取液進(jìn)行HPLC、TLC指紋圖譜和水分、總灰分、醇浸出物含量等理化特征研究，其水分、總灰分、醇浸出物含量均值分別為8.21%、6.22%、6.20%，水分含量和醇浸出物含量測(cè)定的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可能是受取樣量和試驗(yàn)精度要求的影響，醇浸出物含量測(cè)定的穩(wěn)定性要稍差些。

與關(guān)于臭常山所含化學(xué)成分的分離鑒定文獻(xiàn)報(bào)道不同，本研究重點(diǎn)在臭常山的理化特征和脂溶性生物堿的提取工藝，影響其提取因素的順序依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲提取時(shí)問(wèn)>料液比；正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件為：65%乙醇作為提取劑，料液比1 g：20 mL，超聲提取時(shí)間80 min，提取3次，脂溶性生物堿提取率為0.385%。富集到的脂溶性生物堿抗肺炎球菌、金黃色葡萄球菌及其他抑菌活性可進(jìn)行深入研究。