丁鴿　張代臻　張華彬　唐伯平

摘要：為探討山東海域口蝦蛄種群的遺傳多樣性，本研究對山東東營、煙臺、長山島、青島、日照5個樣地72個樣本，通過線粒體COⅠ基因進行遺傳多樣性評價，共獲得了72條580 bp的DNA序列，定義了30個單元型，31個變異位點，分析得出單元型多樣性為0.8700，核苷酸多樣性為0.004 024；種群問遺傳距離在O.000 9～0.003 8之間。種群內(nèi)單元型問遺傳距離分別為煙臺（0.004 1）、青島（0.004 2）、東營（0.002 7）和日照（0.002 9）。同時揭示煙臺、青島的遺傳多樣性較高，而東營、日照遺傳多樣性則相對較低。系統(tǒng)發(fā)生樹體現(xiàn)了山東海域種群單元型交錯分布特性。歧點分布和中性檢驗值揭示口蝦蛄在歷史上存在快速擴張的事實。

關(guān)鍵詞：口蝦蛄；種群；遺傳多樣性

中圖分類號：S931.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0254—03

山東海岸線跨越渤海與黃海，具有豐富的海洋生物資源，海產(chǎn)品口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）別稱皮皮蝦、蝦耙子等，是口足目的優(yōu)勢種，屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustaeea）口足目（Stomatopota）蝦蛄科（Squillidae）口蝦蛄屬。口蝦蛄生活在水深不足60 m的淺海海域，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富且具有較大的經(jīng)濟價值，是沿海重要的養(yǎng)殖漁業(yè)種之一。近年來，隨著沿海經(jīng)濟的快速增長，對口蝦蛄的大量捕撈而導(dǎo)致其野生資源迅速減少，這勢必導(dǎo)致野生口蝦蛄群體遺傳多樣性的降低。加之工業(yè)污水、養(yǎng)殖廢水的任意排放導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境日益破壞，嚴(yán)重影響了近海生態(tài)環(huán)境，破壞了口蝦蛄等海洋生物的生境，目前亟需對海洋生物資源的遺傳狀況進行科學(xué)評價。

線粒體DNA具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、變異大、無組織特異性特點，尤其編碼線粒體細胞色素C氧化酶基I（cyto-chromec oxidase subunit 1，CO Ⅰ）的基因被作為物種鑒別和遺傳水平評價的遺傳標(biāo)記，在海洋動物的分類、遺傳多樣性分析和資源評價等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本研究通過線粒體CO，基因?qū)ι綎|海域的東營、煙臺、青島、長山島及日照等5個樣地72只口蝦蛄的遺傳多樣性水平進行評價，為口蝦蛄野生資源的遺傳狀況和資源保護提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究中所用的口蝦蛄樣本采集于山東海域的東營、煙臺、青島、長山島及日照5個地方（表1）。樣本肌肉組織保存于體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中備用。

1.2萬法

1.2.1材料預(yù)處理及基因組提取 用滅菌的剪刀取口蝦蛄背部肌肉置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL雙蒸水脫乙醇，每隔2 h換水1次，直到乙醇被徹底洗脫，然后用常規(guī)的酚一氯仿法提取總基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 PCR反應(yīng)在ABI 9700 PCR擴增儀上進行，用于CO，基因擴增的特異性引物為KLCOI-1490：5′-GGTCAAATCATAAAGATATTGG-3′和KLCOI-2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR總體積為30μL，反應(yīng)體系中含有3μL 10×buffer，2μL dNTPs，1μLDNA模板，3μL MgCl₂，上下游引物（10 pmol/L）各1μL及0.2μL Taq酶。加18.8μL ddH₂O補足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，運行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（上海華舜）純化后，用ABI PRISM BigDye測序反應(yīng)試劑盒（Perkin-Elmer）在ABI 3730全自動DNA測序儀上完成序列測定。

1.2.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 序列經(jīng)Dnastar軟件進行拼接后，結(jié)合人工校對，再使用Clustal X軟件對該序列進行DNA序列對位排列。獲得的比對序列用Mega 3.0軟件分析序列核苷酸的堿基組成和單元型，計算基于Kimura雙參數(shù)的單元型及種群遺傳距離。用Arlequin 3.01軟件計算種群內(nèi)以及種群問的核苷酸多樣性水平、單元型多樣性水平等。DnaSP 4.10和Arlequin 3.01軟件分析不同種群問的遺傳分化指數(shù)（F_st）、基因交流大?。∟_m）及中性檢驗；Mega和MrBayes軟件構(gòu)建單元型的遺傳進化系統(tǒng)樹。

2結(jié)果

2.1 CO I基因片段堿基組成及序列變異分析

通過基因組提取、PCR擴增、純化和測序，本研究分別測得山東的東營、煙臺、長山島、青島、日照5個區(qū)域共72個樣本的CO，基因序列片段，經(jīng)過對位排列和序列剪接后共存在580位點（表2），在這些位點中，統(tǒng)計得到4種核苷酸堿基含量的平均值分別為A=27.6%，T=37.1%，G=17.7%，C=17.6%，其中T的含量最高，C的含量最低，A+T（64.7%）明顯高于G+C（35.3%）。在580位點中共定義了31個變異位點，且變異位點中轉(zhuǎn)換與顛換的比值為3.113，可見轉(zhuǎn)換高于顛換。

2.2種群的單元型分析

根據(jù)獲得的山東海域口蝦蛄72條序列，統(tǒng)計分析共定義了30個單元型，分別命名為H1～H30。在30個單元型中，被共享個體數(shù)最多的是H4，被來自東營、煙臺、青島、長山島及日照種群共計24個體共享，占據(jù)了個體總數(shù)的1/3。此外，被共享單元型還有H1、H2、H3、H5、H15、H20、H26（表2）。

在遺傳多樣性分析中，5個種群中單元型多樣性（表3）最高的是煙臺種群（0.964 29），遠超平均單元型多樣性水平，其次青島的單元型多樣性水平（0.947 37）也遠高于平均水平，但是長山島（0.852 63）、東營（0.800 00）、日照（0.785 71）卻遠遠低于平均單元型多樣性水平，且日照的單元型多樣性水平最低。核苷酸多樣性水平方面，東營和日照較低，分別為0.002 70和0.002 89，而煙臺（0.004 06）、青島（0.004 17）、長山島（0.004 30）的核苷酸多樣性都遠超平均值。2.3種群間的遺傳距離及系統(tǒng)樹

本研究通過雙參數(shù)模式計算了種群問的遺傳距離（表4），根據(jù)所獲得的結(jié)果可以看出，種群問的遺傳距離在0.000 9～0.003 8之間，而遺傳距離最小的種群則是青島和長山島之間（0.000 9），遺傳距離最大的是東營和煙臺種群之間（0.003 8）。5個種群內(nèi)部單元型之間的遺傳距離從大到小依次為長山島（0.004 3）、青島（0.004 2）、煙臺（0.004 1）、日照（0.002 9）、東營（0.002 7）（表4）?；?0個單元型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)將所有單元型分為3個大支，而5個種群沒有明顯以地理分布而聚集成5個簇，而是互相交錯分布，未形成顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)（圖1）。

根據(jù)Arlequin 3.01軟件對山東海域口蝦蛄的歧點分布和中性檢驗進行分析，結(jié)果顯示，5個種群歧點分布均呈單峰結(jié)構(gòu)，中性檢驗Fus Fs值和Tajimas D值為，日照Fus Fs：-1.543，Taiima's D：-1.280 11；青島Fu's Fs：-8.255，TajimaD：-1.970 85；長山島Fus Fs：-8.022，Taiimas D：-2.020 16；東營Fu's Fs：-0.304，Tajima's D：-0.457 21；煙臺Fus Fs：-3.990，Tajima's D：-0.603 86。

3結(jié)論

在本研究測得口蝦蛄線粒體CO，基因片段中，A+T的百分含量遠大于G+C的平均含量，變異位點中含有轉(zhuǎn)換與顛換的比值為3.113，轉(zhuǎn)換明顯大于顛換，所有數(shù)據(jù)與甲殼動物的線粒體組成特征吻合。種群遺傳多樣性對其環(huán)境適應(yīng)力有很大的影響，遺傳多樣性的降低直接導(dǎo)致了其對環(huán)境適應(yīng)力的降低，通過對山東海域口蝦蛄遺傳多樣性進行初步研究，分析得出單元型多樣性為0.870 0，核苷酸多樣性為0.004 024；種群問遺傳距離在0.000 9～0.003 8之間。煙臺、青島的遺傳多樣性較高，而東營、日照遺傳多樣性則相對較低。種群內(nèi)單元型問遺傳距離分別為煙臺（0.004 1）、青島（0.004 2）、東營（0.002 7）和日照（0.002 9）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)中5個種群沒有明顯以地理分布而單獨聚集，未形成顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)，歧點分布和中性檢驗值揭示口蝦蛄在歷史上存在快速擴張的事實。