余曉東　張鵬　宋發(fā)軍　劉佳　席曉圓　于鵬飛

摘要：研究重樓種子外種皮提取物有機酸、生物堿、酚類對水稻種子萌發(fā)的影響。分別采用堿提酸沉法、酸提法、乙醇浸提法提取重樓種子外種皮中的有機酸、生物堿、酚類，梯度稀釋后處理水稻種子，分析提取物對水稻種子48 h的萌發(fā)率、第10天對苗高、鮮質量以及胚根長的影響。以蒸餾水（CK）作對照。試驗結果，3類提取物與CK相比，在2.5～50.0 mg/mL的處理濃度范圍內對水稻種子48 h的萌發(fā)率、第10天的苗高、鮮質量、胚根長都有抑制作用。在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內，3類提取物對種子萌發(fā)率的抑制作用相差不大，對苗高、鮮質量抑制作用的強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內，3類提取物對種子萌發(fā)率、苗高、鮮質量的抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。此外，還發(fā)現(xiàn)每類提取物對胚根長度的抑制作用要強于對其他指標的抑制，且在整個處理濃度范圍內抑制作用的強弱順序是：生物堿>酚類>有機酸。通過研究明確了3類物質對種子萌發(fā)抑制作用的效果，確定了有機酸、生物堿、酚類是存在于重樓種子外種皮中的3類萌發(fā)抑制物，研究結果為深入研究重樓種子的休眠機制提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：重樓種子；外種皮；有機酸；生物堿；酚類；萌發(fā)

中圖分類號：Q945.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0096—03

重樓又名七葉一枝花，為百合科重樓屬重要藥用植物。重樓種子休眠程度高，自然條件下需要兩冬一夏才能萌發(fā)，且萌發(fā)率低。種皮吸水障礙、胚休眠和種子中存在抑制類物質是種子休眠的三大原因。常見的萌發(fā)抑制物有有機酸、生物堿、酚類、醛類、不飽和內酯、脫落酸、芳香油、芥子油、氣體物質等。滇重樓的外種皮肉質多汁，櫻紅色，具有角質層，在維持種子休眠中起著重要作用，然而重樓種子外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物卻鮮有報道。本研究采用堿提酸沉法、酸提法、乙醇浸提法提取重樓種子外種皮中的有機酸、生物堿、酚類物質，并研究3類物質對水稻種子萌發(fā)的影響，以期確定外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物，為深入研究重樓種子的休眠機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 重樓外種皮：2013年9—10月于湖北省恩施州巴東縣采集重樓種子后，脫去外種皮，并將其烘干至恒重備用。

1.1.2試劑 飽和鹽酸乙醚、碳酸氫鈉、無水乙醇、冰乙酸、濃鹽酸、乙酸乙酯，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 JP-150A型高速多功能粉碎機，永康市久品工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；RK1028型超聲波清洗機，BANDELINSONOREX SUPER；5810R型臺式大容量冷凍離心機，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；RE-52型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1 3類物質提取與梯度稀釋 有機酸、生物堿、酚類的提取分別采用堿提酸沉法、酸水提取法、乙醇浸提法。3種提取液母液濃度均為50 mg/mL。準確稱取10 g外種皮粉末，按上述方法提取，將得到的3種提取液蒸干后再用蒸餾水定容至200 mL，并分別按2、5、10、20倍進行稀釋，得到濃度分別為25.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的梯度稀釋液。

1.2.2浸種及培養(yǎng) 水稻種子在37℃條件下浸種12 h后置于鋪有雙層紗布的培養(yǎng)皿中，每皿50粒種子，并分別用10 mL 5種濃度的3種提取液處理水稻種子，蒸餾水作對照（CK），每個處理3次重復。室溫培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)過程中根據(jù)皿中種子的干濕情況，加入2～5 mL處理液。

1.2.3指標測定浸種48 h開始統(tǒng)計水稻種子萌發(fā)率，第10天測定水稻幼苗苗高、鮮質量、胚根長度，并按[相對抑制率=1-處N/對照]×100%，計算提取物對水稻幼苗胚根長的相對抑制作用。

1.3統(tǒng)計分析

采用Excel 2003和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2結果與分析

2.1提取物對水稻種子萌發(fā)率的影響

3類提取物對水稻種子萌發(fā)都有一定的影響，并隨著濃度增加，對水稻種子萌發(fā)的抑制作用逐漸增強（圖1）。與對照相比，2.5 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用不明顯，5～25 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用顯著，但各個濃度間差異不明顯，而50 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用更強，萌發(fā)率與對照相比降低了15%。生物堿在2.5～50.0 mg/mL的濃度范圍內，隨著濃度增加，對水稻種子萌發(fā)的抑制作用逐漸增強，且抑制作用極顯著，而當濃度為25、50 mg/mL時，水稻種子已不再萌發(fā)。酚類提取物在2.5～10.0 mg/mL的濃度范圍內對水稻種子萌發(fā)無明顯影響，而在25～50 mg/mL時對水稻種子萌發(fā)的抑制作用極顯著，萌發(fā)率迅速降低。結果表明，在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內，3類提取物對水稻種子萌發(fā)的抑制作用相差不大，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內，生物堿的抑制作用最強，酚類次之，有機酸最弱。

2.2提取物對水稻幼苗苗高和鮮質量的影響

提取物對水稻幼苗苗高和鮮質量的影響見圖2、圖3。與對照相比，2.5～10.0 mg/mL的有機酸對苗高、鮮質量的影響不明顯，但在25～50 mg/mL時，有機酸對苗高、鮮質量的抑制作用極顯著，當濃度為50 mg/mL時，水稻苗高、鮮質量分別下降了69.4%、21.4%。生物堿在2.5～50.0 mg/mL對苗高、鮮質量的抑制作用均為極顯著，且抑制作用隨著濃度的升高而增強，與對水稻種子萌發(fā)率的抑制效果相吻合。酚類在2.5～25.0 mg/mL的濃度范圍內對苗高、鮮質量的抑制極顯著，但不同濃度間差異不顯著，而當濃度增至50 m/mL時，其抑制作用達到最強，苗高、鮮質量分別降低了77.9%、31.2%。與對水稻種子萌發(fā)率的抑制不同的是，在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內，3類提取物對苗高、鮮質量抑制作用的強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內，抑制作用的強弱順序依次是生物堿>酚類>有機酸。

2.3提取物對水稻幼苗胚根生長的影響

3類提取物對幼苗胚根長的抑制最為明顯，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強（圖4）。當有機酸、生物堿、酚類3類提取物的濃度均為2.5 mg/mL時，它們對胚根長的相對抑制率分別為2.5%、88.2%、75.2%，而當濃度升為50 mg/mL，相對抑制率竟高達70.9%、100.0%、99.7%（圖5）。綜上所述，抑制作用的強弱順序是生物堿>酚類>有機酸。3類提取物對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響見圖6。

3討論

研究表明，種胚發(fā)育不完全，種子中存在萌發(fā)抑制物是重樓種子休眠的主要原因。古今等發(fā)現(xiàn)滇重樓種皮和種子中均存在著一定活性的抑制物質，且抑制物質的活性隨著提取液濃度的增加而增加，種子是抑制物質存在的主要部位，抑制物的活性比種皮中的明顯。黃瑋等研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓種子的萌發(fā)抑制物質只存在于種子中，外種皮中并無萌發(fā)抑制物的存在，外種皮的抑制作用可能是疏水的外種皮阻止了萌發(fā)抑制物質的溢出。與上述研究結論不同的是，王躍華等研究發(fā)現(xiàn)，華重樓種子外種皮的水提液對青菜、榨菜、白菜3種植物種子的萌發(fā)以及幼苗生長都具有明顯抑制作用。因此，外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物及含有的萌發(fā)抑制物類型需要進行深入研究。

本研究結果，3類提取物在2.5～50 mg/mL的處理濃度范圍內對水稻種子萌發(fā)率、苗高、鮮質量、胚根長都有抑制作用，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強。在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內，3類提取物對種子萌發(fā)率的抑制作用相差不大，對苗高和鮮質量抑制作用強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內，3類提取物對種子萌發(fā)率、苗高、鮮質量的抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。3類提取物對胚根長的抑制作用要強于對其他指標的抑制，在整個處理濃度范圍內抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。

Cruz-Chacon等發(fā)現(xiàn)，當異葉番荔枝種子吸脹和萌發(fā)時，與芐基異喹啉生物堿合成有關的4種酶在發(fā)育的胚中均被監(jiān)測到存在激活現(xiàn)象，而胚乳中并無酶活力，表明生物堿的合成與胚的早期生長發(fā)育密切相關。Muscolo等發(fā)現(xiàn)，從2種不同植被的森林土壤中提取的酚類物質對自拉瑞斯歐松樹種子萌發(fā)均存在抑制作用，而這些種子未萌發(fā)和糖酵解及磷酸戊糖途徑中所涉及到的酶的活力受到抑制強烈相關。姚軍等發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸、苯甲酸和肉桂酸均抑制了加工番茄不同品種種子的萌發(fā)，表現(xiàn)在萌發(fā)率、胚根長較對照均有顯著降低，而且隨有機酸濃度的增加，這種抑制程度也逐漸增強。本研究分析了重樓外種皮中有機酸、生物堿、酚類對水稻種子萌發(fā)的影響，比較其對種子萌發(fā)及幼苗生長抑制作用的強弱，最終確定了重樓外種皮中存在這3類萌發(fā)抑制物。研究結果可為進一步闡明重樓外種皮中萌發(fā)抑制物的類型、深入研究重樓種子的休眠機制提供理論依據(jù)。