顧地周+劉宇+王曼寧+沈紅梅+陸爽+朱俊義

摘要：以牛尾菜果實成熟后的種子為供試材料，通過多因子交叉重復(fù)試驗對影響牛尾菜種胚發(fā)育的主要因素及其水平進行了探討，篩選并確定調(diào)控牛尾菜種胚快速發(fā)育的主要因素及水平。結(jié)果表明，牛尾菜種胚發(fā)育成熟的方法、主要因素及其水平為種子用4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA混合溶液浸泡72 h，將種子與河沙按1：3混合，進行80 d的變溫處理，變溫幅度和時間為白天溫度（22±2）℃、處理10 h，夜間溫度（13±2）℃、處理14 h，盾形胚發(fā)生率99.7%，子葉胚發(fā)生率98.3%，種子發(fā)芽率95.8%以上。解決了牛尾菜種胚發(fā)育調(diào)控和育苗技術(shù)，該技術(shù)適合于牛尾菜種苗的工廠化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：牛尾菜；種胚；發(fā)育；調(diào)控技術(shù)；激素；變溫

中圖分類號：S647.04 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0071—03

牛尾菜（Smilax riaria DC.）別稱心葉牛尾菜、龍須菜、鞭桿子菜，屬百合科菝葜屬多年生宿根植物，為長白山藥食同源的重要植物資源。牛尾菜早春幼嫩的莖葉可以食用，口感好，無異味，是極具營養(yǎng)價值的山野菜，為我國野菜出口品種之一。有研究證明其嫩莖葉中含有的總氨基酸量遠超過一般蔬菜，其嫩葉中還含有豐富的Ca、Zn、Fe、維生素類等營養(yǎng)物質(zhì)，也是提供膳食纖維的很好來源；全草含白須根皂苷、蒽醌苷、皂角苷等，其根和根莖入藥，有活血化瘀、祛痰止咳等功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、筋骨酸痛、偏癱、頭暈、頭痛、咳嗽吐血和骨結(jié)核等癥。除食用和藥用外，牛尾菜的根莖可提取淀粉，富含鞣質(zhì)，可用來提取栲膠，種子里還含有種子油，是釀造等工業(yè)的重要原材料。

牛尾菜果實成熟后，種子中的種胚處于球形胚階段，這樣的種子播種當(dāng)年不萌發(fā)，需要2～3年才能少量發(fā)芽，生產(chǎn)和開發(fā)利用受到極大限制。為解決種胚發(fā)育和種苗繁育存在的難點，開展了變溫處理，但種胚發(fā)育仍然存在發(fā)育緩慢、子葉胚發(fā)生率較低等缺點。大量研究表明，在組織培養(yǎng)中，2，4-D和6-BA搭配使用可誘導(dǎo)植物體細胞形成胚性愈傷組織，胚性愈傷組織可進一步分化出胚胎，胚胎相當(dāng)于種子中的種胚，可直接發(fā)育形成完整的植株。因此，本研究應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育理念對牛尾菜種胚發(fā)育進行激素和變溫同步調(diào)控的方法，以期篩選確定影響種胚發(fā)育的主要因素及其水平，從而解決牛尾菜種子萌發(fā)和育苗等存在的困難，為牛尾菜大規(guī)模人工栽培提供種子處理方法和技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料及處理

秋季（10月中旬），采集牛尾菜果實（果實變黑后），將果實用清水浸泡3～5 d后，去除果皮、果肉、果穗及漂浮在水面的種子后，取水底的種子倒入不同質(zhì)量濃度的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）混合溶液中浸泡72 h后，撈出種子與河沙按1：3拌勻后裝入透氣性好的木槽中，覆蓋塑料薄膜置于處理室中進行變溫處理。

1.2影響種胚發(fā)育的主要因素及水平篩選

種子處理液中含有的2，4-D和6-BA質(zhì)量濃度分別初步控制在1.00～3.25 mg/L和2.50～4.75 mg/L范圍內(nèi)（由預(yù)試驗后設(shè)定），處理期限初步為20～65 d，變溫幅度和時間：白天溫度為（22±2）℃、處理10 h，夜間溫度為（13±2）℃、處理14 h。為提高牛尾菜種胚發(fā)育的速度和各時期胚胎發(fā)生率，通過均勻設(shè)計法設(shè)計試驗，選用U₁₀（10³）、U₆（6³）和U₆（6²）均勻表，每處理100粒種子，重復(fù)3次，取平均值，確定牛尾菜種胚發(fā)育過程中2，4-D和6-BA溶液的質(zhì)量濃度及處理時間對盾形胚和子葉胚發(fā)生的影響。對照組采用同樣數(shù)量的種子用清水浸泡72 h后僅采用變溫處理（處理時間和變溫幅度同上），在處理過程中每5 d取種子觀察種胚形態(tài)，按每100粒種子形態(tài)發(fā)育到下一階段胚胎的百分率為考察對象，種胚形態(tài)發(fā)生計算公式為：盾形胚發(fā)生率=含有盾形胚的種子數(shù)/100×100%；子葉胚發(fā)生率=含有子葉胚的種子數(shù)/100×100%。

1.3播種和苗期管理

經(jīng)過處理后已形成子葉胚的種子可直接播種至畦上，覆蓋細土，土層為0.5～0.8cm，澆透水，再用適量松針覆蓋保濕，待種子發(fā)芽。種子完全萌發(fā)后，每隔20 d用噴壺于葉面噴施1次0.5%磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑2%樂果乳油以防止菜青蟲。秋季枯萎后可將根莖翻出定植，行距15 em，株距8cm，第2年春可發(fā)出整齊芽苗。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

通過均勻設(shè)計法進行試驗設(shè)計，試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后摸索出影響牛尾菜種胚發(fā)育各階段胚胎發(fā)生率主要因素的顯著性，在此基礎(chǔ)上再進一步補充試驗篩選確定影響牛尾

2.3 6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種胚子葉胚發(fā)育的影響

由“2.1”節(jié)中篩選結(jié)果可知，6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種胚子葉胚發(fā)育影響顯著，2，4-D對牛尾菜種胚子葉胚發(fā)育影響不顯著。因6-BA和變溫處理時間與子葉胚發(fā)生率均呈正相關(guān)，由此推測，6-BA質(zhì)量濃度高于4.75 mg/L、變溫處理超過65 d時，可能牛尾菜有更高的子葉胚發(fā)生率。為驗證此推測，又以6-BA質(zhì)量濃度為4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00 mg/L，變溫處理時間為65、70、75、80、85、90 d開展6個處理的補充試驗，重復(fù)3次，取平均值（表3）。操作過程同“1.1”“1.2”節(jié)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6-BA菜種胚發(fā)育各階段胚胎發(fā)生率主要因素的適宜水平，均勻設(shè)計軟件采用Uniform Design 3.0。

2結(jié)果與分析

2.1影響牛尾菜種胚形態(tài)后熟的主要因素的顯著性初步篩選

2.2 2，4-D、6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種胚盾形胚發(fā)育的影響

由“2.1”節(jié)中篩選結(jié)果可知，2，4-D、6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種胚盾形胚發(fā)育影響顯著。因2，4-D、6-BA和變溫處理時間與盾形胚發(fā)生率均呈正相關(guān)，由此推測，2，4-D、6-BA質(zhì)量濃度分別高于3.25、4.75 mg/L以及變溫處理時間超過65 d，可能牛尾菜有更高的盾形胚發(fā)生率。為驗證此推測，又以2，4-D質(zhì)量濃度為3.25、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度為4.75、5.00、5.25、5.00、5.25、5.50 mg/L，變溫處理時間為65、70、75、80、85、90 d開展6個處理的補充試驗，重復(fù)3次，取平均值（表2）。操作過程同“1.1”“1.2”節(jié)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2，4-D質(zhì)量濃度為4.50 mg/L、6-BA為5.75 mg/L、變溫處理時間為80 d時，種胚可發(fā)育至盾形胚（圖1-b），且盾形胚發(fā)生率較高，平均發(fā)生率最高可達99.7%（P<0.05），比表1所列10個處理和對照組的盾形胚發(fā)生率均高。質(zhì)量濃度為5.75～6.00 mg/L、變溫處理時間為65～80 d時，種胚可歷經(jīng)盾形胚發(fā)育至子葉胚（圖1-c），且子葉胚發(fā)生率較高，平均發(fā)生率最高可達98.3%（P<0.05），比表1所列10個處理和對照組子葉胚發(fā)生率均高。

通過以上試驗數(shù)據(jù)處理和分析可知，影響盾形胚的因素及水平是2，4-D質(zhì)量濃度4.50 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度5.75 mg/L和變溫處理時間80 d，而影響子葉胚的因素及水平是6-BA質(zhì)量濃度為5.75～6.00 mg/L和變溫處理時間65～80 d。因此，可以確定牛尾菜種子后熟的條件為種子用4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA混合溶液浸泡72 h后，將種子與河沙按1：3拌勻后裝入透氣性好的木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進行80 d的變溫處理，變溫幅度和時間：白天溫度為（22±2）℃、處理10 h，夜間溫度為（13±2）℃、處理14 h后，牛尾菜種胚由球形胚歷經(jīng)盾形胚發(fā)育形成可萌發(fā)的子葉胚。

2.4播種和苗期管理

根據(jù)“1.2”節(jié)中的方法，經(jīng)過含有4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA的混合溶液浸泡72 h后，變溫處理80 d的種子不需再低溫冷凍或赤霉素處理（生理后熟）即可直接播種，播種35 d后發(fā)芽（圖2-a，圖2-b），發(fā)芽率可達到95.8%以上，此時，芽可長至1.0 cm，根長可達2.0～4.5 cm（圖2-c），15 d后，子葉完全展開（圖2-d，圖2-e），苗高可達8.0 cm以上，每隔20 d用噴壺于葉表面和背面噴施1次0.5%磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑2%樂果乳油以防止菜青蟲的侵食。秋季，待地上部分枯萎后，可將當(dāng)年的根莖翻出定植于土床上，行距15 cm，株距8 cm，第2年春宿根可發(fā)出整齊的芽苗。

3結(jié)論與討論

由試驗結(jié)果可知，牛尾菜種子后熟的條件和方法是種子用4.50 mg/L 2，4-D和5.75 mg/L 6-BA混合溶液浸泡72 h后，將種子與河沙按1：3拌勻后裝入透氣性好的木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進行80 d的變溫處理，變溫幅度和時間：白天溫度為（22±2）℃、處理10 h，夜間溫度為（13±2）℃、處理14 h。牛尾菜種胚由球形胚歷經(jīng)盾形胚發(fā)育形成可萌發(fā)的子葉胚。種子不需再低溫冷凍或赤霉素處理（生理后熟）即可直接播種萌發(fā)。

在盾形胚發(fā)育過程中，由回歸分析結(jié)果可知，2，4-D、6-BA和變溫處理時間均對牛尾菜種胚盾形胚發(fā)育影響顯著。通過計算可知，2，4-D、6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種胚盾形胚發(fā)育影響的貢獻率分別是58.4%、2.42%和60.6%，變溫處理時間和2，4-D遠大于6-BA的貢獻，說明變溫處理時間和2，4-D對盾形胚發(fā)育起主要調(diào)控作用，這可能是因為2，4-D和變溫處理在調(diào)控過程中導(dǎo)致細胞產(chǎn)生一定量的乙烯類或過氧化物酶、超氧化物歧化酶及淀粉酶等酶類活性發(fā)生變化，從而加速和促進了胚性細胞的發(fā)育進程；適當(dāng)濃度的6-BA對牛尾菜盾形胚發(fā)育起到不可缺少的輔助調(diào)控作用，可能是因為乙烯類或酶類需要6-BA的協(xié)同作用才能完成牛尾菜種胚盾形胚的發(fā)育。而在子葉胚發(fā)育過程中，6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種子子葉胚發(fā)育影響顯著，2，4-D對牛尾菜種子子葉胚發(fā)育影響不顯著，6-BA和變溫處理時間對牛尾菜種子子葉胚發(fā)育影響的貢獻率分別是18.7%和94.1%，變溫處理時間遠大于6-BA的貢獻，6-BA盡管對子葉胚的發(fā)育貢獻較小，但影響顯著。這可能是因為種胚子葉胚形成需要適當(dāng)濃度的6-BA以促進和調(diào)控牛尾菜胚性細胞的進一步趨向功能和器官分化，并經(jīng)盾形胚最終發(fā)育形成可萌發(fā)的子葉胚。

種子通過適當(dāng)濃度的2，4-D和6-BA浸泡后，進行合理的變溫處理，即可播種，可能是牛尾菜種子不具有生理休眠的本身特性決定的，也可能是2，4-D、6-BA和變溫處理的共同作用，致使種子中促進萌發(fā)的相關(guān)酶或赤霉素產(chǎn)生變化，6-BA具有“許可”促使物質(zhì)（GA₃）起作用的能力，導(dǎo)致生理休眠的解除或促進生理后熟。

牛尾菜是我國珍貴的經(jīng)濟植物資源，因其育苗存在的難點，導(dǎo)致至今未得到大規(guī)模人工栽培和推廣應(yīng)用，本研究解決了牛尾菜種胚發(fā)育調(diào)控和育苗技術(shù)，該技術(shù)具有方法簡便、成本低和可操作性強等優(yōu)點，適合于牛尾菜種苗的工廠化生產(chǎn)，對牛尾菜進一步人工規(guī)?；耘嗌a(chǎn)、帶動農(nóng)民栽培致富、拉動農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和推動野生經(jīng)濟植物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。