李杰　雒雅婧　張爽　杜克久

摘要：以融合pMDCesAP-GUS、pJCesAP-GUS、pDMDCesAP-GUS的轉(zhuǎn)基因楊樹作為試驗(yàn)材料，分別對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行創(chuàng)傷及ABA（脫落酸）激素誘導(dǎo)處理，通過定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因楊樹不同器官的GUS酶活性，分析不同啟動(dòng)子對(duì)創(chuàng)傷及ABA激素誘導(dǎo)的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，創(chuàng)傷處理轉(zhuǎn)基因楊樹12 h時(shí)，PMDCesAP楊樹根的GUS酶活力達(dá)到最高點(diǎn)。ABA激素處理轉(zhuǎn)基因楊樹，pBI121在根、葉中的GUS酶活力的趨勢(shì)是先升高后降低；處理3 h時(shí)，GUS酶活力最高；pBI121的莖在ABA激素處理前GUS酶活力是最高的；PMDCesAP的根、莖在ABA激素處理前GUS酶活力處于最大值。

關(guān)鍵詞：楊樹；木質(zhì)部特異啟動(dòng)子；創(chuàng)傷誘導(dǎo)；脫落酸誘導(dǎo)；GUS活性

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0063—05

啟動(dòng)子是直接調(diào)控基因特異性表達(dá)的重要元件，它驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，并決定基因表達(dá)的強(qiáng)度、時(shí)間和空間等特異性。由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在植物不同組織器官中均有不同程度的表達(dá)，應(yīng)用中逐漸暴露出導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株生長(zhǎng)緩慢、植株變矮、產(chǎn)量下降等問題，因此研究和利用組織器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有非常重要的意義。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期分別從3倍體毛白楊-93（Populustomentosa Carr.-“93”）、加楊-1（Populus canadensis Moench.-“1”）中分離了具有木質(zhì)部組織特異性的MDCe-sAP啟動(dòng)子和JCesAP啟動(dòng)子。通過生物信息學(xué)分析表明，2個(gè)啟動(dòng)子序列均含有與損傷防御有關(guān)的順式作用元件，還有大量其他與激素、水分等誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。本試驗(yàn)以融合pMDCesAP-GUS、pJCesAP-GUS、pDMDCesAP-GUS的轉(zhuǎn)基因楊樹作為試驗(yàn)材料，分別對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行創(chuàng)傷及ABA（脫落酸，abscisic acid）處理，通過定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因楊樹不同器官的GUS酶活性，分析不同啟動(dòng)子對(duì)創(chuàng)傷及ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)情況，從而為進(jìn)一步分析啟動(dòng)子中決定組織特異性及誘導(dǎo)性的調(diào)控元件奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

前期已通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將3個(gè)筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的植物表達(dá)載體pMDCesAP-GUS（含MDCesAP啟動(dòng)子-GUS融合基因）、pJCesAP-GUS（含JCesAP啟動(dòng)子-GUS融合基因）、pDMDCesAP-GUS（含2個(gè)串聯(lián)MDCesAP啟動(dòng)子-GUS融合基因）的轉(zhuǎn)基因毛白楊作為試驗(yàn)材料；同時(shí)將轉(zhuǎn)入pBll21（含35S啟動(dòng)子-GUS報(bào)告基因）的毛白楊作為陽(yáng)性對(duì)照、轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGLI的毛白楊作為陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因的毛白楊組培苗為CK。

1.2材料處理

創(chuàng)傷處理：無(wú)菌水清洗以上楊樹組培苗，用濾紙吸干表面水分，用剪刀將根剪成長(zhǎng)1.5 cm的小段（除盡根部組織培養(yǎng)基）；采用鑷子對(duì)楊樹苗莖段部分造成機(jī)械創(chuàng)傷；用剪刀將葉片剪下，剪掉葉脈，留下純?nèi)~片，剪成1 cm×1 cm的小塊。每種樣品的不同部位分別稱質(zhì)量0.1 g，放人1.5 mL的離心管，25℃光照條件下分別處理0、3、6、12、24 h。

ABA激素誘導(dǎo)處理：將以上楊樹苗按照創(chuàng)傷處理的方法進(jìn)行處理，于1.5 mL離心管中加入3倍體積的1 mmol/L的ABA將其浸泡。

1.3轉(zhuǎn)基因楊樹GUS報(bào)告基因熒光定量檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉，每份樣品取0.1 g，加入3倍體積的GUS提取緩沖液，研磨成粉末，于12000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，加入2 mmol/L的GUS反應(yīng)底物4-MUG，迅速充分混勻后，用0.2 mol/L Na₂CO₃終止反應(yīng)。利用RF-5301PC熒光儀，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)455 nm，測(cè)定蛋白含量，以1 min水解4-MUG生成1 nmol/L4-MU的酶量為1個(gè)酶活力單位（U），以每mg蛋白的酶活力表示GUS活性（U/mg），各試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理轉(zhuǎn)基因楊樹的特異性表達(dá)分析

2.1.1同一啟動(dòng)子在相同處理時(shí)間不同組織器官的酶活性變化 由圖1-A可知，創(chuàng)傷處理0 h時(shí)，在根中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的70.9%、48.7%和0.7%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP有顯著差異性（P<0.05）。在莖中，pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，比陽(yáng)性對(duì)照pBll21增加了52.2%；pMDCe-sAP、pDMDCesAP的GUS活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的64.1%和59.0%，且pJCesAP與pMDCesAP和pDMDCesAP有顯著差異，pMDCesAP和pDMDCesAP之間的差異不顯著。在葉中，pMDCesAP和pDMDCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的1.78倍和2.43倍；pJCesAP的GUS活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的57.9%；pMDCesAP與pDMDCe-sAP和pJCesAP有顯著差異，pJCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間沒有顯著差異。

由圖1-B可知，創(chuàng)傷處理3 h時(shí)，在根中，pMDCesAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的2.39倍和1.24倍；pDMDCesAP的活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的50.9%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP有顯著差異性（P<0.05）。在莖中，pJCesAP的GUS活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的18.5%，pMDCesAP、pDMDCesAP的活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.22和1.1倍，pMDCesAP與pDMDCe-sAP和pJCesAP有顯著差異，pDMDCesAP和pJCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間無(wú)顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCe-sAP和pJCesAP的GUS活性均很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的6.4%、23.9%和13.2%，DDMDCesAP與DMDCesAP和pJCe-sAP有顯著差異，pMDCesAP和pJCesAP之間沒有顯著差異。

由圖1-C可知，創(chuàng)傷處理6 h時(shí)，在根中，pMDCesAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的17.70倍和6.63倍；pDMDCesAP的活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的2.9%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP之間有顯著差異性，pDMDCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121沒有顯著差異。在莖中，pMDCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的1.22倍，pDMDCesAP和pJCesAP的活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的27.4%和32.1%；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP有顯著差異性，pDMDCesAP和pJCesAP沒有顯著差異。在葉中，pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.91倍，pMDCesAP的GUS活性變化不大，pDMDCesAP的活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的14.2%；pJCesAP與pMDCesAP和pDMDCesAP有顯著差異，pMDCesAP與pJCesAP之間有差異性，與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間差異不明顯，pDMDCesAP與pJCesAP有顯著差異，與陽(yáng)性對(duì)照pBll21和pMDCesAP沒有顯著差異。

由圖1-D可知，在根中，創(chuàng)傷處理12 h時(shí)，pMDCesAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的5.53倍和1.86倍，而pDMDCesAP的活性則為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的42.8%；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互問有顯著差異性。在莖中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性變化不明顯；pMDCesAP和pJCesAP之間沒有顯著差異，但與pDMDCesAP有顯著差異；pDMDCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121也沒有顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性均在增加，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.42倍、1.78倍和2.04倍；pDMDCesAP和pJCesAP之間沒有顯著差異，但均與pMDCesAP有顯著差異。

由圖1-E可知，在根中，創(chuàng)傷處理24 h時(shí)，pMDCesAP和pJCesAP的GUS活性在增加，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的1.52倍和2.37倍；pDMDCesAP的活性在減少，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的26.3%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互問有顯著差異性（P<0.05）。在莖中，pMDCesAP的GUS活性比陽(yáng)性對(duì)照pBI121增加了33.4%；pDMDCesAP和pJCesAP的活性在減少，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的69.0%和95.3%；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異性，pJCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBll21沒有顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCe-sAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，是陽(yáng)性對(duì)照pBll21的21.9倍、6.9倍和13.3倍；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異性。

2.1.2不同啟動(dòng)子的相同器官隨處理時(shí)間不同的酶活性變化將各轉(zhuǎn)基因楊樹的根部做創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖2-A。pBll21隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力在創(chuàng)傷處理6 h時(shí)處于低谷；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理12 h時(shí)，GUS酶活力最高，是處理0 h時(shí)最低酶活力的10.15倍；pDMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體變化不大，在創(chuàng)傷處理6 h時(shí)達(dá)到低谷；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力整體呈增加趨勢(shì)，處理12 h時(shí)的GUS酶活力達(dá)到峰值；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活在創(chuàng)傷處理24 h達(dá)到峰值；CK隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力增長(zhǎng)不明顯，在創(chuàng)傷處理6 h時(shí)達(dá)到低谷。

將各轉(zhuǎn)基因楊樹的莖部做創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖2一B。pBll21隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理3 h時(shí)處于峰值，是處理0 h時(shí)最低酶活力的2.85倍；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理6 h時(shí)GUS酶活力最高，是處理0 h時(shí)最低酶活力的6.7倍；pDMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，在創(chuàng)傷處理12 h時(shí)達(dá)到峰值；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力基本呈先降低后增加的趨勢(shì)，創(chuàng)傷處理12 h時(shí)的GUS酶活力達(dá)到峰值；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先降低后增加的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理24 h時(shí)達(dá)到峰值；CK隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力整體增長(zhǎng)不明顯，在處理0 h時(shí)達(dá)到低谷。

將各轉(zhuǎn)基因楊樹的葉部做創(chuàng)傷誘導(dǎo)處理，結(jié)果見圖2-C。pBI121隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體呈先增加后降低的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理3 h時(shí)達(dá)到峰值，是處理24 h時(shí)最低酶活力的22.3倍；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先降低后增加的趨勢(shì)，在創(chuàng)傷處理24 h時(shí)GUS酶活力最高，是處理3 h時(shí)最低酶活力的15.4倍；pDMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，創(chuàng)傷處理6 h時(shí)達(dá)到低谷；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力基本呈增加趨勢(shì)，處理24 h時(shí)的GUS酶活力達(dá)到峰值；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力增長(zhǎng)不明顯；CK隨處理時(shí)間的增加，在處理6 h時(shí)基因基本處于沉默狀態(tài)。

2.2 ABA激素誘導(dǎo)各轉(zhuǎn)基因楊樹的特異性表達(dá)分析

2.2.1同一啟動(dòng)子相同處理時(shí)間在不同組織器官的酶活性變化由圖3-A可知，ABA誘導(dǎo)處理0 h時(shí)，在根中，pMDC-esAP、pDMDCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.75倍和2.75倍；pJCesAP的GUS活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的15.2%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互問有顯著差異性（P<0.05）。在莖中，pMDCesAP、pDMDCe-sAP和pJCesAP的活性均很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的14.0%、16.1%和9.0%，pMDCesAP與pJCesAP有顯著差異，pMDCesAP與pDMDCesAP、pJCesAP之間沒有顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的活性均很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的0.2%、55.5%和21.3%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互問有顯著差異性。

由圖3-B可知，ABA誘導(dǎo)處理3 h時(shí)，在根中，pMDCe-sAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的1.20倍和2.12倍；pDMDCesAP的活性很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的13.1%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP有顯著差異性（P<0.05），pMDCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121無(wú)顯著差異。在莖中，pMDCesAP的GUS活性與陽(yáng)性對(duì)照pBI121的變化不大，pDMDCesAP、pJCesAP的活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.68倍和6.57倍，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異（P<0.05），pMDCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間無(wú)顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性均很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的10.3%、9.9%和11.7%，pDMDCesAP、pMDCesAP和pJCesAP之間沒有顯著差異。

由圖3-C可知，ABA誘導(dǎo)處理6 h時(shí)，在根中，pMDCe-sAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的1.22倍和2.23倍；pDMDCesAP的活性與陽(yáng)性對(duì)照pBI121的的活性相差不大，pJCesAP與pMDCesAP、pDMDCesAP之間有顯著差異性（P<0.05），pMDCesAP與pDMDCesAP沒有顯著差異。在莖中，pMDCesAP的GUS活性在減少，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的51.8%，pDMDCesAP和pJCesAP的活性在增加，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的1.43倍和3.51倍，pMDCesAP、pDMDCe-sAP和pJCesAP相互間有顯著差異性（P<0.05），pMDCe-sAP、pDMDCesAP與pJCesAP沒有顯著差異。在葉中，pMDC-esAP、pDMDCesAP和pJCesAP GUS活性均很弱，僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的15.2%、18.1%和19.7%，pMDCesAP、pDMDCe-sAP、pJCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121有顯著差異（P<0.05）；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間差異不顯著。

由圖3-D可知，ABA誘導(dǎo)處理12 h時(shí)，在根中，pMDCe-sAP和pJCesAP的GUS活性很強(qiáng)，為陽(yáng)性對(duì)照pBll21的3.52倍和5.91倍，而pDMDCesAP的活性僅為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的49.8%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著性差異（P<0.05）；pDMDCesAP和pJCesAP之間沒有顯著差異。在莖中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性均減少，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的14.0%、31.7%和57.8%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異。在葉中，pJCesAP的活性在增加，是陽(yáng)性對(duì)照pBll21的1.33倍；pMDCesAP和pDMDCesAP的GUS活性在減少，為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.4%和81.9%，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異性（P<0.05）。

由圖3-E可知，ABA誘導(dǎo)處理24 h時(shí)，在根中，pMDCe-sAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性均在增加，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的2.99倍、3.02倍和1.28倍；pJCesAP與pM-DCesAP和pDMDCesAP之間有顯著差異性，pMDCesAP和pDMDCesAP沒有顯著差異，pJCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間也沒有顯著差異。在莖中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCe-sAP的GUS活性均為增加，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的1.21倍、1.75倍和2.12倍；pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異性，pMDCesAP與陽(yáng)性對(duì)照pBI121之間沒有顯著差異。在葉中，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP的GUS活性均很強(qiáng)，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的6.19倍、3.41倍和1.91倍，pMDCesAP、pDMDCesAP和pJCesAP相互間有顯著差異性。

2.2.2不同啟動(dòng)子的相同器官隨處理時(shí)間不同的酶活性變化 將各轉(zhuǎn)基因楊樹的根部做ABA誘導(dǎo)處理，結(jié)果（圖4-A）表明，pBI121隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，在ABA處理3 h時(shí)GUS酶活力達(dá)到高峰，是處于低谷的處理24 h時(shí)的6.29倍；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體上呈降低的趨勢(shì)，ABA處理0 h時(shí)GUS酶活力最高，是處理24 h時(shí)最低酶活力的2.97倍；pDMDCe-sAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力在ABA處理0 h時(shí)達(dá)到頂峰，處理12 h時(shí)達(dá)到低谷；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力相對(duì)于處理0 h時(shí)均是增加的，在ABA處理3 h時(shí)，GUS酶活力達(dá)到峰值，是處理0 h酶活力的46.8倍；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活在ABA處理12 h達(dá)到峰值；CK隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加后降低的趨勢(shì)，在處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，處理24 h時(shí)到達(dá)低谷。

將各轉(zhuǎn)基因楊樹的莖部做ABA誘導(dǎo)處理，結(jié)果（圖4-B）表明，pBI121隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先降低后增加再降低的趨勢(shì)，在ABA處理0 h時(shí)GUS酶活力達(dá)到高峰，處理3、6、24 h時(shí)GUS酶活力相差不大且均很低，在處理12 h時(shí)GUS酶活力卻增加了；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體上沒有發(fā)生大的變化，ABA處理0 h相對(duì)較高；pDMDCesAP隨處理的增加，GUS酶活力總體上呈先增加后降低的趨勢(shì)，在ABA處理3 h時(shí)達(dá)到高峰，是處理6 h的2.98倍；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體呈先增加后降低的趨勢(shì)，在ABA處理3 h時(shí)達(dá)到高峰，是處理0 h時(shí)酶活力低谷的5.6倍；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活在ABA處理12 h達(dá)到峰值；CK隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體呈先降低后增加的趨勢(shì)，在處理3 h時(shí)達(dá)到最低谷。

將各轉(zhuǎn)基因楊樹的葉部做ABA誘導(dǎo)處理，結(jié)果（圖4-C）表明，pBI121隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力呈先增加再降低的趨勢(shì)，在ABA處理3 h時(shí)達(dá)到高峰，在處理24 h時(shí)處于低谷；pMDCesAP隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力總體上呈增加的趨勢(shì)，ABA處理24 h達(dá)到高點(diǎn)；pDMDCesAP隨處理的增加，GUS酶活力總體上呈先降低后增加的趨勢(shì)，在ABA處理0 h時(shí)達(dá)到高峰，是處理3 h時(shí)活力低谷的4.3倍；pJCesAP隨處理時(shí)間的增加，在ABA處理12 h時(shí)GUS酶活力達(dá)到高峰；AGLI隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活呈先增加后降低的趨勢(shì)；CK隨處理時(shí)間的增加，ABA處理3 h時(shí)GUS酶活力處于高峰，處理6 h時(shí)達(dá)到最低谷。

3討論與結(jié)論

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期分離的MDCesAP啟動(dòng)子、JCesAP啟動(dòng)子以及經(jīng)過改造的DMDCesAP復(fù)合啟動(dòng)子經(jīng)功能檢測(cè)均具有木質(zhì)部組織特異性。通過生物信息學(xué)分析表明，3個(gè)啟動(dòng)子序列均含有與損傷防御有關(guān)的順式作用元件，還有大量其他與激素、水分等誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。為了研究三者是否同時(shí)具有響應(yīng)傷害及ABA處理的誘導(dǎo)啟動(dòng)子特性，進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。結(jié)果表明：在創(chuàng)傷處理3 h后，pMDCesAP根部的GUS酶活力均大于陽(yáng)性對(duì)照pBI121根部的GUS酶活力，尤其在處理6 h時(shí)，GUS酶活力為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的17.7倍；pMDCesAP莖部的GUS酶活力自創(chuàng)傷處理3 h后，與陽(yáng)性對(duì)照pBI121相比也表現(xiàn)出較高的活性；但在創(chuàng)傷處理24 h時(shí)，pMDCesAP葉部的GUS酶活力明顯升高，并高于根及莖中的GUS酶活力。由此可見，MDCesAP在創(chuàng)傷處理后3—12 h之間，表現(xiàn)出明顯的木質(zhì)部組織特異性及創(chuàng)傷誘導(dǎo)活性。創(chuàng)傷處理下pDMDCesAP的GUS酶活性變化規(guī)律不明顯。在創(chuàng)傷處理0 h時(shí)，pJCesAP在莖中的GUS酶活性很強(qiáng)，比陽(yáng)性對(duì)照pBI121增加了52.2%，但隨處理時(shí)間的增加，GUS酶活力基本呈先降低后增加的趨勢(shì)，創(chuàng)傷處理12 h時(shí)的GUS酶活力達(dá)到峰值，且僅在處理0、3 h表現(xiàn)出木質(zhì)部組織特異性。另外，3個(gè)啟動(dòng)子在創(chuàng)傷處理24 h時(shí)，組織特異性表現(xiàn)均不明顯，但pMDCesAP、pJCesAP在根、莖、葉中的GUS酶活力均大于陽(yáng)性對(duì)照pBI121相應(yīng)部位的GUS酶活力。

在ABA處理試驗(yàn)中，處理0～24 h后，pMDCesAP根部的GUS酶活力均大于陽(yáng)性對(duì)照pBI121根部的GUS酶活力，尤其在處理0 h時(shí)，GUS酶活力為陽(yáng)性對(duì)照pBI121的4.75倍。由此可見，MDCesAP在ABA處理后，均表現(xiàn)出明顯的木質(zhì)部組織特異性及創(chuàng)傷誘導(dǎo)活性。ABA處理下，pDMDCesAP的GUS酶活性在0 h最強(qiáng)，是陽(yáng)性對(duì)照pBI121的2.75倍，隨后呈現(xiàn)下降、增加、下降、增加的規(guī)律性變化。ABA處理3～12 h時(shí)，pJCesAP在根中的GUS酶活力均高于陽(yáng)性對(duì)照pBI121，在3、6 h時(shí)，莖中的GUS酶活力也高于陽(yáng)性對(duì)照pBI121，且表現(xiàn)出木質(zhì)部組織特異性。另外，3個(gè)啟動(dòng)子在創(chuàng)傷處理24 h時(shí)，組織特異性表現(xiàn)均不明顯，但在根、莖、葉中的GUS酶活力均大于陽(yáng)性對(duì)照pBI121相應(yīng)部位的GUS酶活力。

植物誘導(dǎo)抗性是新興的抗病蟲害策略，在病蟲害防治中有著廣闊的應(yīng)用前景，日益受到人們的關(guān)注。組織特異性及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因的表達(dá)策略已成為植物抗性基因工程育種研究中的一大熱點(diǎn)。但是天然的特異型啟動(dòng)子大多表達(dá)水平不高，不能滿足人們的多種需要。因此，對(duì)現(xiàn)有的天然啟動(dòng)子進(jìn)行人工改造，利用不同種類啟動(dòng)子中特異性順式調(diào)控元件及增強(qiáng)子序列去構(gòu)建高活性的、同時(shí)受多種因素調(diào)控的復(fù)合式啟動(dòng)子將是一個(gè)十分重要的解決問題途徑。本試驗(yàn)結(jié)果說明，在啟動(dòng)子中，決定組織特異性相關(guān)的順式作用元件與決定誘導(dǎo)特性的其他順式作用元件既可以共同協(xié)助，又可以互相抑制，從而調(diào)節(jié)目的基因在特定的時(shí)間、空間及一定環(huán)境條件下表達(dá)，其具體的作用模式有待進(jìn)一步研究。