何姍姍　趙婷婷　姜景彬　李景富　許向陽(yáng)

摘要：以含有Cf-19基因的番茄抗葉霉病品種CGN18423為材料，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)克隆番茄抗葉霉病相關(guān)基因細(xì)胞色素P450 90A1-like（CYP 90A1-like）部分序列，片段長(zhǎng)295 bp；以番茄八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）基因作為陽(yáng)性對(duì)照，片段長(zhǎng)349 bp。測(cè)序結(jié)果表明，序列與番茄同源性達(dá)100%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果顯示，在番茄感染葉霉病后，隨時(shí)間延長(zhǎng)CYP90A1-like基因相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明該基因在番茄抗葉霉病過(guò)程中有重要作用；以煙草脆裂病毒（TRV2）為載體，成功構(gòu)建CYP 90A1-like、PDS基因的病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）重組載體。構(gòu)建的pTRV2-CYP 90A1-like、pTRV2-PDS重組載體將為下一步利用VIGS技術(shù)在番茄上研究CYP 90A1-like基因與番茄抗葉霉病的關(guān)系奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄；細(xì)胞色素P450 90A1-like基因；八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）；病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）

中圖分類號(hào)：S641.203 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0029—03

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指攜帶目標(biāo)基因片段的重組載體在通過(guò)各種方法侵染植株后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因下調(diào)表達(dá)或者不表達(dá)的現(xiàn)象。目前該技術(shù)廣泛用于番茄、煙草、小麥、水稻，在大麥、馬鈴薯等作物上的應(yīng)用也有報(bào)道。研究表明，利用VIGS技術(shù)已經(jīng)使得一些基因在番茄中被成功沉默，如NPR1、TGA1a、NbCA1、NTF6、MEK1、MEK2等多個(gè)抗病相關(guān)基因。VIGS具有技術(shù)簡(jiǎn)單、研究周期短、侵染效率高、不需要遺傳轉(zhuǎn)化等優(yōu)勢(shì)，這種反向遺傳學(xué)新技術(shù)已成為一種低成本、高通量地鑒定植物中各種基因功能的新技術(shù)，在植物功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。

1995年，Kumagai等利用人工構(gòu)建的植物內(nèi)源基因片段在本氏煙中首次將PDS基因進(jìn)行沉默。八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）是影響類胡蘿卜素合成的限速酶之一，常將該基因作為評(píng)價(jià)VIGS是否成功的參照基因。在番茄、柑橘等花或果實(shí)以類胡蘿卜素為主要色素的植物中，隨著類胡蘿卜素含量增加，PDS基因表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)。若該基因被成功沉默，植株將會(huì)表現(xiàn)幼嫩葉片漂白的癥狀，表型變化易于觀察辨別。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等細(xì)胞內(nèi)，在植物體內(nèi)參與植物激素等化合物的生物合成、代謝解毒以及抗病等重要生理活動(dòng)。Frear等于1969年首先在棉花中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450，隨后在小麥、水稻和擬南芥等作物中也陸續(xù)分離出細(xì)胞色素P450。細(xì)胞色素P450的研究主要集中于其在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能，它不僅參與植物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝，更重要的是參與植物的次生代謝，在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生很多重要的、可以抵抗病蟲(chóng)害以及環(huán)境脅迫的次生代謝產(chǎn)物。

本研究分別構(gòu)建CYP90A1-like、PDS基因的VIGS載體并對(duì)載體進(jìn)行鑒定，以證明其可靠性，為下一步分析基因沉默后的植株感病情況提供試驗(yàn)材料，以便進(jìn)一步探討該基因與番茄抗葉霉病之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

以番茄含有Cf-19基因的抗病品種CGN18423為試驗(yàn)材料，葉霉菌生理小種為1.2.3.4.（筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供）。番茄試驗(yàn)材料在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站溫室內(nèi)常規(guī)種植。在苗期，生長(zhǎng)至四葉一心時(shí)取新鮮葉片用于基因片段克隆。分別采集感染葉霉菌0、3、5、7、9、15、20 d后的陽(yáng)性植株與對(duì)照組植株葉片，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）。以上材料采集后均立即用液氮冷凍，并在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1番茄葉片總RNA提取及cDNA第1鏈合成按照筆者所在實(shí)驗(yàn)室改良的Trizol法進(jìn)行總RNA提取，用超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。利用cDNA第1鏈合成試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 CYP 90A1-like、PDS基因片段的克隆、測(cè)序根據(jù)GenBank中公布的番茄CYP 90A1-like基因片段序列（登錄號(hào)：JZ717738），設(shè)計(jì)特異引物，引物序列見(jiàn)表1。20μL CYP90A1-like基因片段的PCR擴(kuò)增體系為：各2μL cDNA和上、下游引物，10μL 6×Taq MasterMix、4μLddH₂O。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

電泳檢測(cè)并進(jìn)行膠回收后，基因片段分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證、測(cè)序。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）檢測(cè)CYP 90A1-like基因與抗葉霉病的相關(guān)性分別采集幼嫩葉片，提取感染葉霉菌0、3、5、7、9、15、20 d的陽(yáng)性植株與對(duì)照組植株的RNA，以番茄肌動(dòng)蛋白基因Actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)3次，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)感病后CYP90A1-like基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4載體的構(gòu)建及鑒定 CYP 90A1-like基因采用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切，連接到同樣用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切的pTRV2載體中，將雙酶切之后的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收處理，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

將菌液提取質(zhì)粒PCR進(jìn)行雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，獲得正確序列的載體質(zhì)粒即為重組載體pTRV2-CYP90A1-like、pTRV2-PDS。

2結(jié)果與分析

2.1番茄葉片總RNA提取質(zhì)量分析

按照筆者所在實(shí)驗(yàn)室改良的Trizol法提取番茄葉片總RNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，D_260nm/D_280nm范圍為1.94～1.98。圖1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S、18S2條帶明亮、無(wú)拖帶，且28 s條帶亮度是18 s條帶的2倍，表明RNA質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

2.2番茄CYP90A1-like、PDS基因片段的克隆及測(cè)序結(jié)果

對(duì)基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳檢測(cè)，圖2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，條帶清晰，與預(yù)期大小一致。通過(guò)雙酶切，與載體連接、測(cè)序，圖3、表2序列分析結(jié)果顯示：成功克隆出CYP 90A1-like、PDS基因片段，可用于構(gòu)建病毒載體。

2.3 CYP90A1-like基因?qū)崟r(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析

提取感染葉霉菌0、3、5、7、9、15、20 d后陽(yáng)性植株與對(duì)照組植株的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：陽(yáng)性植株的CYP 90A1-like基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組有明顯上升，且隨感病時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)（圖4）。說(shuō)明該基因與番茄抗葉霉病相關(guān)，并在抵抗葉霉病過(guò)程中有重要作用。

2.4基因的VIGS重組載體構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將基因片段連接大腸桿菌感受態(tài)，涂板過(guò)夜，提取質(zhì)粒，與病毒載體用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，T₄DNA連接酶連接；然后將重組病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌液PCR以及雙酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，為陽(yáng)性克隆，詳見(jiàn)圖5、圖6。

3討論與結(jié)論

番茄葉霉病在番茄中普遍存在，可迅速傳播，對(duì)番茄果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此，研究番茄抗葉霉病相關(guān)基因?qū)τ诳共∑贩N改良等方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。通過(guò)對(duì)抗病相關(guān)基因的研究也可以為抗病品種選育提供新的思路和途徑，也可為其他園藝作物的研究提供借鑒。

番茄CYP 90A-like基因是參與抗葉霉病過(guò)程的關(guān)鍵基因，在抗葉霉病過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，驗(yàn)證該基因的功能也具有十分重要的意義。傳統(tǒng)研究植物基因功能的方法存在研究周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低等缺點(diǎn)，而VIGS技術(shù)能夠突破這些問(wèn)題，使其成為研究植物基因功能優(yōu)質(zhì)、高效的新手段。煙草脆裂病毒（TRV）是VIGS中常用的病毒載體，利用TRV載體進(jìn)行基因沉默時(shí)，可通過(guò)種子將沉默的表型遺傳給后代，而且其沉默的表型可以維持2年。

本研究通過(guò)對(duì)番茄CYP 90A1-like、PDS基因片段的克隆及序列分析，進(jìn)行酶切鑒定，構(gòu)建了pTRV2-CYP 90A1-like、pTRV2-PDS重組病毒載體。期望下一步在番茄上通過(guò)VIGS技術(shù)實(shí)現(xiàn)CYP 90A1-like基因沉默，研究該基因?qū)Ψ芽谷~霉病的作用，從而進(jìn)一步豐富和擴(kuò)大VIGS技術(shù)在番茄中的應(yīng)用范圍，旨在為后續(xù)研究番茄抗葉霉病基因和相關(guān)基因的功能提供試驗(yàn)材料，為將來(lái)從分子層面調(diào)控番茄抗葉霉病提供科學(xué)依據(jù)。