張清平梅鑫柯超陳銀生陳芙蓉陳建良陳忠平

·論 著·

Notch1 通路與膠質(zhì)瘤細(xì)胞管道形成能力相關(guān)性研究☆

張清平*梅鑫△柯超△陳銀生△陳芙蓉△陳建良※陳忠平△

目的 探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源的管道（glioma clls derived vessels,GCDV）的形成機(jī)制。方法 將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、U373、SF295、T98G、SKMG-4和C6進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，觀察其管道形成能力。Western blot檢測各個膠質(zhì)瘤細(xì)胞株Notch1、Dll4蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 三維培養(yǎng)C6細(xì)胞單個視野下（100×）的平均管道數(shù)(25.2±5.0)個，U373為(36.4±3.20)個，U87為(19.0±2.2)個，T98G為(12.6±2.4)個，SF295為(4.0±2.)個，U251為(0.2± 0.4)個，SKMG-4為0。Notch1在U87、U251、T98G、SF295、SKMG-4、C6、U373表達(dá)相關(guān)密度分別為0.34、0.21、0.79、0.04、0.28、1.75、1.19，與管道形成能力顯著相關(guān)(r=0.778,P=0.019)；Dll4表達(dá)相關(guān)密度與管道形成能力不相關(guān)(r=0.635,P=0.062)。結(jié)論 Notch1蛋白表達(dá)與細(xì)胞株管道形成能力密切相關(guān)，而Dll4蛋白的表達(dá)與細(xì)胞株管道形成能力有待進(jìn)一步探索。

Notch1 膠質(zhì)瘤 三維培養(yǎng) 管道形成

血管擬態(tài)（vasculogenic mimicry,VM）是靶向血管新生治療的重要靶點(diǎn)[1]，腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時管道形成能力是其體內(nèi)發(fā)生血管擬態(tài)能力的反映。目前對于管道形成能力的機(jī)制研究提示血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[2]、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）[3]、CD31[4]、VE鈣粘蛋白[5]、基質(zhì)金屬蛋白2（MMP-2）[6]、層粘連蛋白（laminin）[7]是重要影響因素。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中有明顯的血管擬態(tài)現(xiàn)象發(fā)生，并在膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時證實(shí)了其管道形成能力[8]，但影響管道形成能力的因素尚不明了。經(jīng)典的Notch1通路在調(diào)控血管新生上有重要作用[11]，而關(guān)于其在擬態(tài)管道形成的作用尚未有報道。本研究檢測不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株管道形成能力的不同，以及Notch1、以及Notch1的配體Dll4的表達(dá)水平之間的差異，并分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞株管道形成能力與Notch1、Dll4的表達(dá)相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實(shí)驗(yàn)所用膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U87、U251、T98G、SF295、SKMG-4、C6、U373都由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部保存并提供。

1.2 細(xì)胞三維培養(yǎng) 細(xì)胞均培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（美國Gbico公司）中，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2。取細(xì)胞對數(shù)生長期時段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將20μL matrigel膠（美國BD公司）平鋪在35mm培養(yǎng)皿中。取狀態(tài)良好的細(xì)胞消化成單個細(xì)胞后 DMEM培養(yǎng)基重懸并添加 10ng/ mLVEGF和10%胎牛血清。按1×105/mL的細(xì)胞濃度接種于matrigel膠；接種后在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6h后觀察。

1.3 Western blot檢測Notch1、Dll4蛋白的表達(dá)情況 常規(guī)方法提取各個細(xì)胞株的蛋白,行SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后。一抗為Anti-Notch1、Anti-Dll4（美國Abcam）兔來源單克隆抗體（1:1000）及β-actin(1:10000)兔來源單克隆抗體,二抗（美國Abcam）為辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔抗體 (1:10000),浸泡于發(fā)光液1min后在暗房中將PVDF膜平鋪于壓片盒，取X光片5張鋪于其上，扣緊壓片盒。曝光時間5min，取出壓片盒中X光片投入自動洗片機(jī)中沖洗。進(jìn)行半定量比較分析,并且均采用自身灰度值校正,以目的基因的條帶灰度與管家基因β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 在100×的放大倍數(shù)下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行管道計數(shù)，并取平均值。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17．0分析，Notch1和Dll4表達(dá)水平與細(xì)胞系管道形成能力采用Pearson相關(guān)性分析,檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株管道形成能力觀察 按照管道形成形態(tài)以及數(shù)量共分為三類（表1）。第一類為強(qiáng)管道形成細(xì)胞株組，為C6和U373細(xì)胞株。C6單個視野下（100×）的平均管道數(shù)（25.2±5.0）個，U373為（36.4±3.2）個。C6和U373細(xì)胞株形成的管道管壁光滑。這兩株細(xì)胞圍成的管道形狀相對規(guī)則，大部分為圓形、橢圓形。每個閉合環(huán)狀的連接處不僅僅只有偽足，更有細(xì)胞互相連接形成管道。細(xì)胞伸出的偽足數(shù)量明顯減少，C6細(xì)胞株幾乎不見有偽足伸出，而U373閉合環(huán)的連接處既有纖細(xì)偽足的連接，也有多個細(xì)胞相互連接構(gòu)成（圖1）。第二類為弱管道形成能力組，為U87、T98G細(xì)胞株。U87單個視野下（100×）的平均管道數(shù)（19.0±2.2）個，T98G為（12.6±2.4）個。U87、T98G細(xì)胞株形成的管道大小極不規(guī)則。這兩株細(xì)胞在生長過程不斷相互聚集，而且每個細(xì)胞伸出較多分支，形成毛刺樣結(jié)構(gòu)。U87細(xì)胞之間的連接似乎更為緊密，每個閉合環(huán)狀的連接處的偽足更為粗壯。相比之下T98G的連接更為纖細(xì)，而且可以看到除了連接在一處的偽足，每個細(xì)胞還有其他未連接在一起的偽足伸出，形態(tài)極似神經(jīng)元細(xì)胞的樹突（圖2）。第三類為無管道形成能力組，為SF295、U251和SKMG-4細(xì)胞株。SF295單個視野下（100×）的平均管道數(shù)（4.0±2.2）個，U251為（0.2±0.4） 個，SKMG-4為 0。SF295、U251和SKMG-4幾乎沒有管道形成。SF295的管道密度大大減少，幾乎沒有互相連接的閉合環(huán)，偶爾見到的少細(xì)胞生長的空洞區(qū)域也較小，中間能夠見到多個細(xì)胞在空洞區(qū)域穿過，很難找到閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。而U251和SKMG-4只能看到細(xì)胞平鋪生長，隨著細(xì)胞密度的增加而逐漸鋪滿培養(yǎng)皿，完全無典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖3）。

表1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株形成管道能力

表2 不同細(xì)胞株管道形成數(shù)量以及Notch1 和Dll4蛋白表達(dá)相關(guān)密度

2.2 Notch1和Dll4的表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤細(xì)胞株管道形成能力的相關(guān)性分析 細(xì)胞株管道形成數(shù)量、Notch1和Dll4蛋白相對密度見表2。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)管道形成數(shù)量與Notch1表達(dá)的相關(guān)性較顯著(r=0.778,P=0.019)。而管道形成數(shù)量與Dll4表達(dá)相關(guān)性不顯著（r=0.635,P=0.062）。

3 討論

圖1 C6和U373細(xì)胞株形成的管道管壁光滑。這兩株細(xì)胞圍成的管道形狀相對更加規(guī)則，大部分為圓形、橢圓形。每個閉合環(huán)狀的連接處不僅僅只有偽足，更有細(xì)胞互相連接形成管道。放大倍數(shù)×100，標(biāo)尺50μm。

圖2 U87、T98G細(xì)胞株形成的管道大小極不規(guī)則。這兩株細(xì)胞在生長過程不斷相互聚集，而且每個細(xì)胞伸出較多分支，形成毛刺樣結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)×100，標(biāo)尺50μm。

圖3 SF295、U251和SKM G-4幾乎沒有管道形成。SF295的管道密度大大減少，幾乎沒有互相連接的閉合環(huán)。而U251和SKM G-4只能看到細(xì)胞平鋪生長，隨著細(xì)胞密度的增加而逐漸鋪滿培養(yǎng)皿，完全無典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)×100,標(biāo)尺50μm。

抗膠質(zhì)瘤血管新生治療療效一直不理想。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抗VEGF-A治療時黑色素瘤細(xì)胞通過分泌HIF1α募集更多的腫瘤細(xì)胞來參與管道形成[9]。然而腫瘤細(xì)胞形成管道能力卻大不相同。ZHU等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞株中BEL-7402和HCCLM6具有管道形成能力，而HepG2卻沒有。BENEDITE等[11]提出Notch1調(diào)控的雙重作用源于結(jié)合的配體不同?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的主要Notch1的配體有：Delta-like 1 (Dll1),Dll3,Dll4, Jagged1和Jagged2。膠質(zhì)瘤中主要表達(dá)Notch1，GBM、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤也有Notch2表達(dá)。Dll4在Notch1的雙重調(diào)控作用起了關(guān)鍵作用。Dll4能阻滯腫瘤血管成熟但在腫瘤血管新生過程中卻表達(dá)上調(diào)。Notch1等通路如果作為抗血管治療的靶點(diǎn)將會影響許多正常體細(xì)胞的功能，因?yàn)檫@些通路不僅在腫瘤細(xì)胞，在很多體細(xì)胞都是高表達(dá)狀態(tài)。因此相對特異性的靶點(diǎn)才是靶向血管新生的治療研究方向。

目前鮮有關(guān)于Dll4-Notch1通路與血管擬態(tài)之間關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)Notch1與血管擬態(tài)之間存在密切的關(guān)系。Notch1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，同時形成管道樣結(jié)構(gòu)[12]。近來有學(xué)者的臨床研究表明Dll4同樣在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)。高表達(dá)的Dll4也促進(jìn)了擬態(tài)血管的形成[13]。這與我們在體外實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論一致。

我們的研究初步發(fā)現(xiàn)能夠形成平滑的環(huán)形管道的細(xì)胞株Notch1的表達(dá)水平相對也高。同樣Dll4的表達(dá)也大致與Notch1的表達(dá)程度相同，這值得我們進(jìn)一步研究Dll4-Notch1通路對GBM腫瘤細(xì)胞來源管道形成調(diào)控的深層機(jī)制。我們希望在拮抗腫瘤血管新生上找到特異性靶點(diǎn)，彌補(bǔ)現(xiàn)有對avastin治療膠質(zhì)瘤的不足。

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The study on Notch1 pathway-related tubular formation of glioma cell lines.

ZHANG Qingping,MEI Xin,KE Chao,CHEN Yingsheng,CHEN Furong,CHEN Zhongping,CHEN Zhongping.Department of Neurosurgery/Neuro-oncology,Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,China.Tel:86-20-87343310.

Objective To explore the mechanism of the formation of glioma cells derived vessels(GCDV). Methods The tubular formation assay was performed on 3D cell cultures of U87,U251,U373,SF295,T98G,SKMG-4 and C6 glioma cell lines.The expression of Notch1、Dll4 were examined by western blot analysis.Result The mean number of vasculogenic channels of cell lines C6,U373,U87,T98G,SF295,U251 and SKMG-4 per area (100×)were 25.2±5.0,36.4±3.2,19.0±2.2,12.6±2.4,4±2.2,0.2±0.4 and 0,respectively.The relative protein densities of Notch1 in U87,U251,T98G,SF295,SKMG-4,C6 and U373 were 0.34,0.21,0.79,0.04,0.28,1.75 and 1.19,which were significantly related with the tubular formation ability (P＜0.05).However,the expression of Dll4 was not associated with tubular formation ability (P＞0.05).Conclusion Notch1 may play a key role in tubular formation of glioma cells while the role of Dll4 in the process needs further study.

Notch1 Glioma 3D cell culture Tubular formation

R331

A

2016-08-21)

(責(zé)任編輯：甘章平)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.011

☆國家自然科學(xué)基金 (編號：81372685)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃)(編號：2015CB755505)；廣東省自然科學(xué)基金 (編號：S2013040012894)；廣東省科技計劃項(xiàng)目（編號：2013B021800067，2016A02013004）；深圳市科技創(chuàng)新委員會項(xiàng)目（編號：JCYJ20140416094330210）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（編號：A2014247）

* 深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科（深圳518033）

△中山大學(xué)腫瘤防治中心神經(jīng)外科

※中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院 深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科